ЗНАЧЕНИЕТО НА НОЯНАТА МИШКА NLRC5 В РАЗЛИЧНИ МОДЕЛИ НА ВЪЗПАЛЕНИЕ В КОНБАТА

Клиника по вътрешни болести I (директор: проф. Д-р Стефан Шрайбер) в Университетския медицински център Шлезвиг-Холщайн, Кампус Кил в Университета на Кристиан Албрехтс в Кил ВАЖНОСТТА НА НОЯННАТА МИШКА НА НЛРК5 В РАЗЛИЧНИ МОДЕЛИ ЗА ВЪЗПАЛЯВАНЕ НА ИМУННАТА СИСТЕМА Инагурационна дисертация в дисертация Факултет на Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, представен от NICOLINA LARA BÖTTCHER от Kiel Kiel 2012

значението

1. Докладчик: проф. Д-р Розенстиел 2-ри репортер: проф. Д-р Grassl Ден на устния изпит: 18 декември 2013 г. Одобрен за печат, Кил, 13 ноември 2013 г., подписан проф. Д-р Laudes

С настоящото заявявам, че дисертацията по темата Значението на нокаутираната мишка Nlrc5 при различни модели на възпаление на вродената имунна система, освен съветите на моя докторски ръководител и другите ми академични учители, е моята собствена работа по отношение на формата и съдържанието и това, освен тези в Не съм използвал други помощни средства, изброени в работата. Маркирах всички буквални или свързани със съдържанието пасажи като такива. Също така потвърждавам, че съм представил приложената дисертация само в тази и в никоя друга докторска процедура и че тази докторска процедура не е била предшествана от никакви в крайна сметка неуспешни докторски процедури. Място, дата, подпис

i Съдържание Списък на съкращенията и термините technici. iii Списък на фигурите. v Списък на таблици. v 1 въведение. 1 1.1 Възпалително заболяване на червата. 1 1.2 Проучвания за генетични асоциации в областта на хроничните възпалителни заболявания. 3 1.3 Автовъзпалителни заболявания. 4 1.4 Вродената имунна система и рецепторът за разпознаване на образци. 5 1.4.1 Генни асоциации от семейството на нодоподобните рецептори с хронични възпалителни заболявания. 7 1.4.2 Семейството на нодоподобните рецептори. 8 1.5 Издание. 11 2 Материал и методи. 13 2.1 Материал. 13 2.2 Мишки. 13 2.3 Експерименти с мишки. 14 2.3.1 Приготвяне на мишки. 14 2.3.2 Ендотоксинов шок. 14 2.3.3 DSS-индуциран колит. 15 2.4 Изолиране на миша тъкан/клетки. 17 2.4.1 Изолация на ДНК от миши опашки. 17 2.4.2 Макрофаги, получени от костен мозък (BMDM). 17 2.4.3 Бели дробове. 19 2.4.4 Стимулиране. 19 2.5 Молекулярни биологични методи. 20 2.5.1 Изолация на РНК от тъкан. 20 2.5.2 cdna синтез. 21 2.5.3 Обратна транскриптазна полимеразна верижна реакция (RT-PCR). 21 2.5.4 Електрофореза в агарозен гел. 22 2.5.5 PCR в реално време. 23 2.5.6 ИФА. 23 2.6 Хистологични методи. 24 2.6.1 Подготовка. 24 2.6.2 Оцветяване с НЕ. 24 2.7 Статистика. 25 3 резултата. 26-ти

ii 3.1 Nlrc5. 26 3.1.1 Геномна организация на миши Nlrc5. 26 3.1.2 Профил на изразяване на Nlrc5. 27 3.1.3 Регулиране на Nlrc5 от Интерферон-γ. 27 3.2 Потвърждение на нокаута. 28 3.3 Базално фенотипизиране на Nlrc5-изтритата мишка. 29 3.3.1 Базална хистология на чревните органи. 29 3.3.2 Основни лабораторни стойности. 32 3.4 Провокационни модели. 33 3.4.1 Ендотоксинов шок. 33 3.4.2 Стимулации от LPS in vitro. 35 3.4.3 Индуциран от натриев декстран сулфат (DSS) колит. 36 4 Дискусия. 42 4.1 Изтритата от Nlrc5 мишка. 42 4.2 Експресия и индукция на миши Nlrc5. 43 4.3 Изтриването на Nlrc5 предпазва в модела на острото възпаление. 44 4.4 Утежнено възпаление на Nlrc5-изтритата мишка при DSS-индуциран колит. 47 4.5 Дихотомен ефект на Nlrc5 при различни модели на възпаление. 49 4.6 Outlook. 53 5 Резюме. 55 Библиография. 56 Приложение Използвани материали. 61 Благодарности. 63 CV. 64

iv RIG RLR RNA Rpm RPMI-1640 RT-PCR sirna SD SEM Tab.TAE Taq TH TLR TMB TNF Tube Well WT Индуцируем ген на ретиноева киселина (RIG) като рецептор Рибонуклеинова киселина Кръгове в минута Мемориален институт на Розуел Парк, специфична среда за клетъчна култура Обратна транскриптаза-полимеразна верижна реакция Малка интерферираща рибонуклеинова киселина Стандартно отклонение Стандартно отклонение средно Таблица Tris-Acetat-EDTA Termophilus aquaticus T-помощна клетка Toll-like-receptor Tetramethylbenzidine Тумор некротичен фактор Пластичен реакционен съд Кладенец в реакционна плоча Див тип мишка или мишки Както често се среща в Английски термини в курсив в тази работа. За по-точна диференциация, гените се пишат също с курсив, за разлика от протеините, а малките букви се използват за миши компоненти и големите букви за хората. В тази работа се използва най-вече настоящата номенклатура на Комитета за генна номенклатура на организацията на човешкия геном от 2008 г. Изключение прави терминът, подобен на Nod, който се използва поради популярността си за нуклеотид свързващия домейн и семейството на богатите на левцин повторения, съдържащо семейството.

Въведение 12 Проведен е тест за ендотоксинов шок, при който интерлевкин-1 играе основна роля. От друга страна, беше използван сложният модел на експериментален колит, който включва както остра фаза с механизми за зарастване на рани, така и хронична фаза със стимулиране на адаптивния имунен отговор. В тази дисертация бяха разгледани следните въпроси: Може ли остра или хронична възпалителна реакция да се модифицира in vivo от генетичния дефицит на Nlrc5? Как изтриването на Nlrc5 влияе върху цитокиновия отговор при острия и хроничен възпалителен отговор? Как структурното сходство на Nlrc5 с другите Nod-подобни рецептори, известни със своята свързаност с определени заболявания, влияе върху ролята му във вродената имунна система?

Материал и методи 25 секунди 70%, 80% и 90% изопропанол, след това 2 х 5 минути 100% изопропанол). Това беше последвано от 3 минути хилен като органичен разтворител и покриване в еукит с покритие. 2.7 Статистика Данните са оценени с програмата GraphPad Prism, GraphPas Software, La Jolla, САЩ. След това тази програма беше използвана за създаване на графики.

Резултати 30 разгледани промени. Островчетата Лангерханс обаче се представиха непроменени.Ако нивата на креатинина на Nlrc5-изтритите мишки бяха понижени, бъбреците също бяха изследвани по-внимателно, гломерулите и тубулите бяха непроменени. Като цяло, Nlrc5-изтритите мишки показаха хистологично, без никакви значими промени по отношение на групата за сравнение на мишки от див тип.

Резултати 31 далак Nlrc5 -/- мишка от див тип мишка (C57BL/6) бели дробове дебело черво лимфни възли бъбреци панкреас Фиг. 7: Базална хистология на изтритата Nlrc5 мишка и мишки от див тип Мишките, изтрити от Nlrc5 и див тип, показват хистологично в HE оцветяването не показва значими разлики.

Резултатите 40 имат значение. След обработка на cdna, експресията на избрани цитокини се измерва с помощта на PCR в реално време. Експресията на интерлевкин-1β в Nlrc5-изтритите мишки се увеличава с 1,7 пъти с относителна единица 0,0024 (мишки от див тип: 0,0014). Експресията на интерлевкин-18 (1,8 пъти), KC (1,4 пъти) и интерферон-γ (1,7 пъти) също е намерена в дебелото черво на Nlrc5-изтритите мишки в сравнение с дебелото черво на мишки от див тип. Мишките се увеличиха след 30 дни DSS колит. За разлика от това, TNF-α беше регулиран надолу. Установено е, че съдържанието на cdna от 0,0006 в Nlrc5-изтритите мишки е 0,6 пъти по-ниско, отколкото при мишки от див тип (0,0011) (Фигура 15). Интерлевкин-12 показва стабилна експресия.