Зависима от желязо регулация на извънхепатния хепцидин - PDF Безплатно изтегляне
1 Университетска болница в Улм Център по вътрешни болести Клиника по вътрешни болести I Медицински директор: проф. Д-р мед. Thomas Seufferlein Зависима от желязо екстрахепатална регулация на хепцидин Дисертация За получаване на докторска степен по стоматология на Медицинския факултет на Университета в Улм, представена от Клара Рут Фрида Брениг от Мюнхен 2013
2 изпълняващ длъжността декан: проф. Д-р Томас Вирт 1-ви репортер: PD Dr. Павел Стрнад 2. Докладчик: проф. Д-р Ден на промоцията на Ларс Булинджър:
4 Съдържание Съдържание Списък на фигурите Списък на таблици Списък на съкращенията III V VI 1 Въведение желязо баланс Експресионни и структурата на Hepcidin Механизми на действие на Hepcidin Регламент на чернодробна hepcidin Hepcidin в екстрахепатални органи Цел на изследователската работа Материал и методи Материали химикали реакционни смеси и буферни разтвори комплекти устройства Методи Животновъдство Експериментална настройка и опитни животни Изолиране на общата РНК от тъкан cdna синтез на първа верига Количествено PCR в реално време Определяне на желязо в тъкан Екстракция на протеин от тъкан Определяне на протеин Western blot Хистология и оцветяване Определяне на серумен феритин и серум
5 Съдържание 3 Резултати Концентрации на серумно желязо и серумен феритин след диети с ниско и високо съдържание на желязо Ефектът на диети с ниско и високо съдържание на желязо върху черния дроб Концентрация на чернодробно желязо Чернодробна експресия Ефектът на диети с ниско съдържание на желязо и високо съдържание на желязо върху екстрахепаталните органи Диети с ниско и високо съдържание на желязо върху стомаха Ефект на диети с ниско и високо съдържание на желязо върху панкреаса Ефект на диети с ниско и високо съдържание на желязо върху бъбреците Ефект на диети с ниско и високо съдържание на желязо върху дванадесетопръстника Ефект на диети с ниско и високо съдържание на желязо върху сърцето Дискусия Системни параметри на желязото в зависимост от съдържанието на желязо в прилаганата диета Локална концентрация на желязо в екстрахепаталните органи в зависимост от съдържанието на желязо в диетата Хепцидин експресии на екстрахепаталните органи в зависимост от диетата индекс 54 Благодарности 63 Автобиография 64 II
8 Списък на таблиците Списък на таблиците Таблица. 1 Последователности на праймера за RT-PCR анализ. Таблица. 2 Железен стандартен разтвор. Таблица. 3 Схема на пипетиране за приготвяне на гел от трицин-SDS-полиакриламид 22 Таблица. 4 Първични антитела. Таблица. 5 Вторични антитела V
9 Списък на съкращенията Списък на съкращенията µ Micro ALK2/APS AS BMP (R) BPS BSA cdna dest DFO DMT DNA dntp DTT ECL GP 80/H 2 O HAMP Hepc1/HFE HJV IFN-γ IL-6 (R) M n NaCl activin receptor-like Киназа2/3 амониев персулфат аминокиселина костен морфогенетичен протеин (рецептор) батофенантролидиндисулфонова киселина динатриева сол телешки серум албумин комплементарна ДНК дестилиран десфероксамин двувалентен метален носител1 дезоксирибонуклеинова киселина дезокси-нуклеотиден амино-аминокиселин амониев аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминокиселин аминохлорид триамфол Рецептор) Моларен нано натриев хлорид VI
10 Списък на съкращенията p PCR psmad qrt RNA rpm SDS SMAD STAT TBS TEMED Tf (R) TGF Tris V Pico Polymerase Chain Reaction Фосфорилиран SMAD Количествени в реално време рибонуклеинови киселини в минута Натриев додецил сулфат Спинална мускулна атрофия и Mothersagainstinececenduces Transceducenceps, N, N, N -Тетраметилетилендиамин 1,2-бис (диметиламино) -етан трансферин (рецептор) Трансформиращ растежен фактор Трис- (хидроксиметил) -аминометан Волт VII
19 1 Въведение Органите обаче са до голяма степен неизследвани. Досега различни проучвания показват, че различни фактори като напр. Претоварването с желязо, възпалението или хипоксията могат да повлияят на локалната експресия на хепцидин в не-чернодробните органи, но механизмът обикновено остава необясним. За да се подобри разбирането за регулацията на извънхепаталния хепцидин, настоящата изследователска работа анализира влиянието на претоварването с желязо или дефицита на желязо върху железния баланс и експресията на хепцидин в различни тъкани. За тази цел мишки от див тип бяха използвани като модел система и хранени с различни диети с желязо. След това влиянието на тези диети върху експресията на хепцидин беше изследвано на нивата на РНК и протеини. Освен това се измерва концентрацията на желязо в тъканите. 9
20 2 Материали и методи 2 Материали и методи Всички химикали, реагенти, комплекти, материали и устройства, използвани в тази работа, са изброени в следващите списъци. 2.1 Материали Химикали Акриламид APS (амониев персулфат) L-аскорбинова киселина β-меркаптоетанол Батофенантролин дисулфонова киселина динатриева сол (BPS) Бисакриламид Говежди серумен албумин (BSA) Брадфордски реагент Бромофенол синьо Coomassie Blue дезоксинуклеотиптрикс дихлорметан диоксид диоксид диоксид диоксид триоксид Dithiothreitol (DTT) ECL Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Bio Rad, Laboratories Gmbh, Мюнхен Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg BIO-RAD Laboratories GmbH, Мюнхен Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен BIO-RAD Laboratories GmbH, Мюнхен PeqLab, Erlangen MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe Amersham Biosciences, Бъкингамшир, Великобритания 10
21 2 Материал и методи Желязо III Неахидрат Нитрат Желязо Карбонат Разработчик Еозин Етанол Фиксиращ разтвор Формалдехид Глицерин Глицин Хематоксилин Изопропанол Калий Хексацианоферрат Хлорид II Ядрен бързочервен метанол Новекс остър протеин Олиго (dT) 20-праймер протеаза RNA Green-RX Green-RX Green-ROX-MINR ROX-MINR RNA-Green RX Green-RO Master Mix SuperScriptIII Обратна транскриптаза Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Tentenal AG & Co KG, Norderstedt Merck KGaA, Darmstadt Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Tetenal AG & Co KG, Norderstedt Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Carl Ко KG, Карлсруе Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Merck KGaA, Дармщат Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Merck, Darmstadt Vector Laboratories, Burlingame, USA Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Dako Deutschland GmbH, Hamburg Invitrogen, Darmstadt Roche, Mannheim Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH, Hilden Qiagen GmbH Hilden Invitrogen GmbH, Дармщат 11
22 2 Материал и методи Солна киселина TEMED (N, N, N, N-Тетраметил-етилендиамин) Трис- (хидроксиметил) - аминометан Tween20 Ксилен Лимонена киселина монохидрат VWR International GmbH, Дармщат Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен Sigma Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен VWR, Ulm Merck KGaA, Дармщат 12
23 2 Материал и методи Реакционни партиди и буферни разтвори Аскорбинова киселина Аноден буфер Блотиращ буфер BPS Coomassie Blue разтвор DNase смес Екстракционен буфер Работен разтвор за оцветяване на желязо Буфер за зареждане с гел (5x) 0,088 g аскорбинова киселина 5 ml H 2 O 24,22 g Tris ad 1L H 2 O 3,03 g Tris 11,26g глицин 100ml метанол и 1L дист. H 2 O ph 8,3 14,76 mg BPS 5 ml H 2 O 400 ml метанол 100 ml етанова киселина 0,4 g Coomassie синьо 250 G ad 1L разст. H 2 O 70µl RDD 10µl DNase/проба 10mM Tris 0,5% Triton X-100 ph 7,5 100ml 2% калиев хексацианоферат II 100ml 1% HCl 1M Tris 10% SDS 50% глицерин 25% β меркаптоетанол бромофенол синьо 375µl разст. H 2 O ph 6.8 13
24 2 Материал и методи Подреждане на гелен буфер Катоден буфер Стандартен разтвор за определяне на желязо Разделящ гел буфер T40/C3 T40/C6 Трис-буфериран физиологичен разтвор (TBS) Трис-буфериран физиологичен разтвор с Tween (TBST) RLT буфер + β ME главен микс за синтез на cdna I 60, 5g Tris до 1L разст. H 2 O ph 6,8 12,11 g Трис 17,92 g Трицин 10 ml SDS ad 1L H 2 O 0,003607 g Желязо III нитрат Неахидрат 1 ml H 2 O 1811,71 g Tris ad 1 L dist. H 2 O ph 8,8 7,76 g акриламид 0,24 g бисакриламид ad 20 ml VE-H 2 O 18,8 g акриламид 1,2 g бисакриламид ad 50 ml VE H 2 O 8,76 g NaCl 1,21 g Tris ad 1L разст. H 2 O ph 7.5 1L TBS 1 ml Tween20 10 µl 1% β меркаптоетанол 1 ml RLT (част от RNeasy Mini Kit) 1 µl Oligo (dT) 20 праймер (0.2 µg/µl) РНК (2 µg) 1 µl dntp-смес (10 mM всеки) ) ad 14 µl вода без RNase 14
25 2 Материал и методи Master-Mix за cdna-синтез II Master-Mix за RT-PCR Primermix Лимонена киселина 4µl Буфер за първа нишка 1µl 0,1M DTT 1µl SuperScriptIII RT (200U/µl) 5µL SYBR-Mix 3µl H 2 O дестинация . 0,03 µl първоначален праймер (100 pmol) 0,03 µl връщащ праймер (100 pmol) до 1 µl H 2 O dist 1,05 g лимонена киселина монохидрат 50 ml H 2 O комплекти RNeasy Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden включва: RDD-буфер с първа верига (буфер без RNase) RNeasy лизисен буфер RLT Rnase-free DNase RW1 RPE устройства 7500 Бърза PCR система в реално време с Софтуер: Откриване на последователност Версия 1.5 KC4 Анализ на данни Софтуер Аналитичен баланс Приложени биосистеми, Дармщат BioTek, Бад Фридрихшал Сарториус АГ, Гьотинген 15
37 3 резултата от контролната диета почти не бяха намалени (86,9 ± 24 µg/g в групата с бедно желязо, 105,2 ± 22,6 µg/g в контролната група. Вижте фигура 6). Концентрацията на желязо в чернодробната тъкан на богатата на желязо група е била 5 пъти по-висока от тази на контролната диета (589,4 ± 243 µg/g в богатата на желязо група). Фигура 5: Хистологично изследване на черния дроб на мишки след диета с ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо. Чернодробната тъкан, оцветена с берлинско синьо оцветяване, показва в (A) тъкан от мишки, хранени със храна с ниско съдържание на желязо, в (B) със стандартна храна и в (C) са били хранени с богата на желязо храна. При мишки, хранени с богата на желязо диета, може да се види значително перипортално натрупване на желязо (стрелка). Увеличение: 20-кратна концентрация на желязо (µg/g) p = 0, EA ST ER Фигура 6: Концентрация на желязо в чернодробната тъкан на мишки след диета с ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо Концентрация на желязо в черния дроб на мишки след 5 седмици ниско съдържание на желязо (EA), стандарт ( ST) и 4-седмична богата на желязо (ER) диета. Показани са средните стойности на най-малко 5 мишки на група Експресия на хепатиден хепцидин Експресията на хепцидин1 и хепцидин2 на бедни на желязо мишки е значително намалена в сравнение с контролната диета (хепцидин1: р = 0,001; хецидин2: 27
40 3 Резултати 400 Концентрация на желязо (µg/g) p = 0, p = 0,03 0 EA ST ER Фигура 9: Концентрация на желязо в далачната тъкан на мишки след бедна на желязо, стандартна и богата на желязо диета Концентрация на желязо в далака на мишки след 5 седмици бедна на желязо (EA), стандартна (ST) и 4-седмична богата на желязо (ER) диета. Показани са средните стойности на поне 5 мишки на група. AB 6 5 Експресия на хепцидин1 спрямо ß-актин p = 0,03 p = 0,05 Експресия на хепцидин2 спрямо ß-актин EA ST ER 0 EA ST ER Фигура 10: Експресия на хепцидин mrna в далака при мишки с ниски нива на желязо, Стандартна и богата на желязо диета (A) Хепцидин1 и (B) Хепсидин2 експресия спрямо експресията на β-актин в далака при мишки след диета, бедна на желязо (EA), стандартна диета (ST) и богата на желязо диета (ER), количествено изчислена от RT -PCR. Резултатите се отчитат като средство за поне 5 мишки на група ± стандартно отклонение. Стойностите са относителни стойности, които са нормализирани по отношение на контрола (= 1). 30-ти
42 3 Резултати A B C Фигура 12: Хистологично изследване на стомашната тъкан на мишките с ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо диета Берлинско синьо оцветяване на корпуса при мишки (A) след хранене с ниско съдържание на желязо, (B) контролна група, (C) група, богата на желязо. Примерни натрупвания на желязо в основните клетки на контролната диета и богатата на желязо диета са маркирани със стрелка. Увеличение: 20 пъти. извършен анализ на тернови блотове и количествена RT-PCR. При анализ на протеини антителата срещу STAT3 и активната форма на STAT3, pstat3, показват лента при 70kDa (виж Фигура 15). Въпреки това, поради постоянната интензивност на обхвата, разследването не разкри никакви доказателства за повишено производство на STAT3. В допълнение, експресията на IL-6 беше измерена с помощта на количествена RT-PCR. Поради изключително ниските нива на експресия беше показано, че няма възпаление (2,3 ± 1,6 в групата, бедна на желязо, 1 ± 0,5 в контролната група, 2,4 в групата, богата на желязо, виж Фигура 16). 32
43 3 Резултати 600 Концентрация на желязо (µg/g) p = 0,007 0 EA ST ER Фигура 13: Промяна в концентрацията на желязо в корпуса на мишки след диета с ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо Концентрация на желязо в корпуса на мишки след 5 седмици ниско съдържание на желязо (EA), стандарт - (ST) и 4-седмична богата на желязо (ER) диета. Мишките, на които се дава стандартна чау, служат като контроли. Показани са средните стойности на поне 5 мишки на група. AB 20 1.5 Експресия на хепцидин1 спрямо ß-актин p = 0.03 Експресия на хепцидин2 спрямо ß-актин 1 0.5 p = 0.04 0 EA ST ER 0 EA ST ER Фигура 14: експресия на mrna im Корпус на мишки след диета с ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо (A) Хепсидин1 и (B) Хепсидин2 експресия спрямо експресията на β-актин в корпуса при мишки след диета с ниско съдържание на желязо (EA), стандартна диета (ST) и диета с високо съдържание на желязо (ER) количествено определена чрез RT-PCR. Резултатите се отчитат като средни стойности ± стандартно отклонение. Стойностите са относителни стойности, които са нормализирани по отношение на контрола (= 1). 33
44 3 Резултати ниско ниво на желязо с високо съдържание на желязо PosKont pstat3 STAT3 ß-тубулин Фигура 15: Експресия на протеин на STAT3/pSTAT3 при мишки след диета с ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо Western blot анализ на стомашната тъкан на мишките след диета с ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо. Антитела: pstat3 (фосфосигнални преобразуватели и активатор на транскрипционен протеин), STAT3 (сигнални преобразуватели и активатор на транскрипционен протеин). Черният дроб PosKont съответства на чернодробната положителна контрола. β-тубулинът е използван като контрол на натоварването. 5 Експресия на IL-6 спрямо ß-актин p = 0,01 0 EA ST ER Фигура 16: Експресия на mrna в корпуса на мишки след експресия на интерлевкин-6 (IL-6) с ниско съдържание на желязо, експресия на IL-6 спрямо β-актин Експресия в корпуса при мишки след диета с ниско съдържание на желязо (EA), стандартна диета (ST) и диета с високо съдържание на желязо (ER), количествено изчислена чрез RT-PCR. Резултатите се отчитат като средно за поне 5 мишки на група ± стандартно отклонение. Стойностите са относителни стойности, които са нормализирани по отношение на контрола (= 1). 34
46 3 Резултати 25 Концентрация на желязо [! G/g] EA ST ER Фигура 18: Концентрация на желязо в панкреаса на мишки след ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо диета Концентрация на желязо в панкреаса на мишки след 5 седмици ниско съдържание на желязо (EA), стандарт (ST) и 4-седмична богата на желязо (ER) диета. Мишките, на които се дава стандартна чау, служат като контроли. Показани са средните стойности на поне 5 мишки на група. AB 2 2 Експресия на хепцидин1 спрямо ß-актин 1 Експресия на хепцидин2 спрямо ß-актин 1 p = 0,03 0 EA ST ER 0 EA ST ER Фигура 19: Експресия на мрна на панкреаса при бедни на желязо, стандартни и богати на желязо мишки Диета (A) Хепцидин1 и (B) Хепсидин2 експресия по отношение на експресията на β-актин в панкреаса при мишки след диета, бедна на желязо (EA), стандартна диета (ST) и богата на желязо диета (ER), количествено изчислена чрез RT-PCR. Резултатите се отчитат като средство за поне 5 мишки на група ± стандартно отклонение. Стойностите са относителни стойности, които са нормализирани по отношение на контрола (= 1). 36
48 3 Резултати 300 Концентрация на желязо [! G/g] EA ST ER Фигура 21: Концентрация на желязо в бъбреците на мишки след диета с ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо Концентрация на желязо в бъбреците на мишки след 5 седмици ниско съдържание на желязо (EA), стандарт (ST ) и 4-седмична богата на желязо (ER) диета. Мишките, на които се дава стандартна чау, служат като контроли. Показани са средните стойности на поне 5 мишки на група. AB експресия на хепцидин1 спрямо ß-актин Експресия на хепцидин2 относителна ß-актин EA ST ER 0 EA ST ER Фигура 22: Експресия на хепцидин mrna на бъбреците при мишки след бедна на желязо, стандартна и богата на желязо диета (A) Хепцидин1 и (B ) Експресия на хепцидин2 спрямо експресията на β-актин в бъбреците при мишки след диета, бедна на желязо (EA), стандартна диета (ST) и богата на желязо диета (ER), количествено изчислена чрез RT-PCR. Резултатите се отчитат като средно за поне 5 мишки на група ± стандартно отклонение. Стойностите са относителни стойности, които са нормализирани по отношение на контрола (= 1). 38
50 3 Резултати 400 Концентрация на желязо [! G/g] p = 0, EA ST ER Фигура 24: Концентрация на желязо в дванадесетопръстника при мишки след диета с ниско съдържание на желязо, стандартна и богата на желязо Концентрация на желязо в дванадесетопръстника на мишки след 5 седмици ниско съдържание на желязо (EA), стандарт (ST) и 4-седмична богата на желязо (ER) диета. Мишките, на които е даден стандартният фураж, служат като контроли. Показани са средните стойности на поне 5 мишки на група. AB 4 2 Експресия на хепцидин1 спрямо ß-актин Експресия на хепцидин2 спрямо ß-актин 1 0 EA ST ER 0 EA ST ER Фигура 25: Експресия на хепцидин mrna в дванадесетопръстника при мишки след бедна на желязо, стандартна и богата на желязо диета (A) Експресия на хепцидин1 и (В) Хепцидин2 по отношение на експресията на β-актин в дванадесетопръстника при мишки след диета, бедна на желязо (EA), стандартна диета (ST) и богата на желязо диета (ER), количествено изчислена чрез RT-PCR. Резултатите се отчитат като средно за поне 5 мишки на група ± стандартно отклонение. Стойностите са относителни стойности, които са нормализирани по отношение на контрола (= 1). 40
51 3 Резултати Ефектът на диетите с ниско и високо съдържание на желязо върху сърцето Не са открити хистологични промени или натрупвания на желязо в сърцето (вж. Фигура 26). Концентрацията на желязо в сърцето съответства на 10% от концентрацията на желязо в черния дроб. Промени между диетата с ниско съдържание на желязо и контролната диета не могат да се видят, но има тенденция към увеличаване на концентрацията в диетата с високо съдържание на желязо (8,5 ± 12,0 µg/g в групата с ниско съдържание на желязо, 3,1 ± 5,7 µg/g в контролната група, 25,7 ± 22,9 μg/g в групата, богата на желязо, виж Фигура 27). В допълнение, нивата на експресия на хепцидин в сърцето също не показват промени (Hepcidin1: 1,5 ± 0,8 в групата, бедна на желязо, 1 ± 0,7 в контролната група, 2,5 ± 1,4 в групата, богата на желязо; Hepcidin2: 1,2 ± 0,3 в групата, бедна на желязо, 1 ± 0,1 в контролната група, 1,3 ± 0,3 в групата, богата на желязо). Вижте фигура 28. ABC Фигура 26: Хистологично изследване на сърцето на мишки след бедна на желязо, стандартна и богата на желязо диета Берлинско синьо оцветяване в сърцето на мишки след (A) хранене с ниско съдържание на желязо, (B) стандартно хранене и (C) хранене с богато на желязо . Увеличение: 20 пъти. 41