Защита на кръвоносните съдове срещу атеросклероза - Ролята на miRNAs, секретирани от

Karine Tréguer 1, 2 *, Susanne Heydt 1 и Eduard Hergenreider 1

съдове

1 Център за молекулярна медицина, Институт за сърдечно-съдова регенерация, Медицински факултет на Университета на Франкфурт, 60590 Франкфурт на Майн, Германия
2 Настоящ адрес: UMR CNRS 5164, Университет Бордо 2, 146, rue Léo Saignat, 33076 Бордо, Франция

Ефект на потока при установяването на атероматозна плака. Горна рамка: Ламинарният поток индуцира експресията на KLF2 в ендотелните клетки (EC). KLF2 е отговорен за поддържането на контрактилния и атеропротективен фенотип на подлежащите гладки мускулни клетки (SMC). Долна рамка: Когато потокът е бурен, около атеросклеротична бифуркация или плака, експресията на KLF2 в ECs намалява и подлежащите SMCs приемат про-атеросклеротичен пролиферативен фенотип. Комуникацията между работническите съвети и CML чрез KLF2 е предмет на това проучване.

MiRNAs: Ново ниво на регулиране на генната експресия

Избраните медиатори на тази комуникация между СЕ и ХМЛ биха били микроРНК (miRNAs). MiRNAs са малки, едноверижни некодиращи РНК (22 нуклеотида), които се транскрибират в ядрото, разцепват се - особено от ензимите Drosha и Dicer - и се включват в комплекс от заглушаване което води до инхибиране на транслацията или разграждане на прицелните иРНК [7, 17]. Тези молекули вече са известни със своята важна роля във васкуларизацията, както и при различни съдови патологии [8]. Нашата цел беше да определим дали KLF2 може да регулира експресията на miRNA в EC и да допринесе за тези васкулопротективни ефекти.

Срязващите сили регулират експресията на miRNA в EC чрез KLF2

Първо определихме miRNAs, регулирани от KLF2 и от срязващи сили в EC. Този двоен анализ направи възможно идентифицирането на нови цели на KLF2 в отговор на потока: клъстер miR-143/145. Ние потвърдихме тези кандидатстващи miRNAs, като анулирахме KLF2 инвитро, и ние показахме, че при липса на KLF2 това клъстер вече не се индуцира от срязващи сили. В допълнение, KLF2 е в състояние да се свърже с промотора на това клъстер и да предизвика неговия израз. Следователно силите на срязване предизвикват експресия на KLF2 в CE и това от своя страна индуцира експресия на miR-143/145. Това клъстер преди това е бил известен със своето атерозащитно действие върху SMCs [9].

miRNA и междуклетъчна комуникация: между CE и CML

Опитахме се да проверим дали KLF2 може да контролира SMC по паракринен начин чрез miR-143/145. Последните проучвания демонстрират наличието на извънклетъчни miRNAs в различните течности на тялото [10], циркулиращи miRNAs, които представляват истински биологични проследяващи при различни патологии като рак [11, 18] или сърдечно-съдови заболявания [12]. Биологичната функция на циркулиращите miRNAs все още не е напълно изяснена, но изглежда, че те могат да играят роля в комуникацията между клетките [13].

Кръвта съдържа множество рибонуклеази и се смята, че циркулиращите miRNAs са защитени от разграждане чрез свързване на протеини или чрез тяхното включване във везикули [15, 16], като последният механизъм е предпочитан. (Фигура 2А).

Анализ на междуклетъчната комуникация. AT. Биохимичен анализ на защитата на извънклетъчните миРНК. Пробата се третира с протеиназа К или детергент за разграждане на протеини или липидни мембрани, след което РНК се разграждат чрез третиране с RNase. Ако те са влошени, това показва, че те са били достъпни и разкрива вида на защитата, протеин или мембрана. Б. Система за съвместна култура за изследване на трансфера на материал между ЕС и СМК. PBS: фосфатен буфер физиологичен разтвор.

Анализирахме супернатантата на CE, свръхекспресираща KLF2 или подложена на напрежение на срязване. Използвайки техниката, описана в Фигура 2, успяхме да покажем, че тези miRNAs присъстват в извънклетъчната среда и са защитени във везикул (Фигура 2А). Различните видове везикули са идентифицирани и класифицирани според техния размер и механизъм на образуване. Задълбочените анализи (по-специално чрез електронна микроскопия) ни позволиха да установим, че везикулите, съдържащи miR-143/145, ще бъдат от микровезикула и/или екзозома (MV).

За да проверим дали SMCs наистина са способни да използват съдържанието на везикули, излъчвани от EC, направихме кокултури между ендотелни клетки, експресиращи eGFP (зелен флуоресцентен протеин) или трансфектирани с miRNA от C. elegans (cel-miR-39) и основните SMC (Фигура 2Б). Имунофлуоресцентният анализ на SMCs показва присъствието на eGFP, а RT-qPCR анализът разкрива присъствието на mRNAs, кодиращи eGFP, демонстрирайки, че ECs предават mRNA везикули на SMCs. Чрез RT-qPCR анализ успяхме да открием и наличието на cel-miR-39 в MVs; те също се предават на SMCs, култивирани с CE, трансфектирани от cel-miR-39. MVs, произведени от ЕС транспортни иРНК и miRNAs и могат да бъдат включени от SMCs.

MiRNAs, съдържащи се в ендотелните MV, имат атеропротективен ефект върху SMCs

miR-143/145, експресиран от двата клетъчни типа, след това се опитахме да проверим дали приносът на тези miRNAs от ЕС действа върху фенотипа на SMC. Поради това инхибирахме ендогенното производство на miRNA в SMCs чрез инхибиране на Drosha (CML KO). Когато тези SMC, които не експресират ендогенни miRNA, се отглеждат в присъствието на CE свръхекспресиращ KLF2, се открива увеличение на miR-143/145. Това показва, че miR-143/145 е транспортиран от ЕС до SMC. И ние показахме, че тези miRNAs, уловени от KO SMC, водят до намаляване на про-атеросклеротичните цели, като ELK1 (E двадесет и шест като транскрипционен фактор I), KLF4 и SSH2 (прашка-I протеинова фосфатаза); следователно ендотелните miRNAs miR-143/145, предадени на SMC, са отговорни за атеропротективните ефекти, наблюдавани при SMC (Фигура 3).