Връзки между клъстери от окислително увредени нуклеотиди и активни или отворени нуклеозоми

субекти

абстрактно

Разпределението на оксидативното увреждане на основи като 8-хидроксигуанин (8-OH-Gua) беше определено на нивото на разделителна способност на нуклеотидите, използвайки лигиращо-медиирана PCR техника. Известно е, че прилагането на бъбречен канцероген, железен (III) нитрилотриацетат (Fe-NTA), предизвиква оксидативен стрес и последващо образуване на 8-OH-Gua в бъбреците. Обща геномна ДНК беше изолирана от бъбречен плъх със или без третиране с Fe-NTA и след това се усвои с формамидопиримидин ДНК гликозилаза (Fpg). Като цел се фокусирахме върху гена за ДНК ензим за възстановяване на тимин гликол, Nth 1. Разделени сигнали бяха открити в екзон 1 и екзон 3, но не и в екзон 5. Нуклеозомите, обогатени с увредени нуклеотиди в тези региони, са много достъпни за микрококова нуклеаза, особено в бъбреците. Вземайки предвид функцията на протеиновия сегмент, кодиран от тези региони, обсъдихме молекулярния механизъм на ограниченото образуване на увредените нуклеотиди.

Въведение

Реактивните кислородни видове (ROS) индуцират различни видове увреждания на ДНК, като едноверижни скъсвания, двуверижни скъсвания, основни модификации, включително места на апурин и апиримид, и омрежване на ДНК-протеин (Dizdaroglu, 1991, 1992; Halliwell и Aruoma, 1991)). Предполага се, че окислителното увреждане на клетъчните геноми играе роля при рака и стареенето (Akman et al., 1991; Basu et al., 1989; Feig et al., 1994; Loeb et al., 1988; Maccabee et al., 1994; McBride et al., 1991; Moriya et al., 1991; Tkeshelashvili et al., 1991; Weitzman and Gordon, 1990; Wood et al., 1990). 8-хидроксигуанинът (8-OH-Gua) е основна форма на окислително увреждане на ДНК (Kasai and Nishimura, 1993; Umemura et al., 1990), която индуцира главно GC → TA трансверсии в Escherichia coli и клетки на бозайници (Cheng et al 1992). Вариациите в количеството на 8-OH-Gua в клетъчната ДНК могат да бъдат измерени чрез HPLC-ECD (Floyd et al., 1986; Kasai, 1997). Въпреки това, връзката между индуцираното увреждане на ДНК и мутационните спектри не е изяснена, тъй като все още не е установен подходящ метод за откриване на увредени нуклеотиди в ДНК in vivo.

Наскоро медиираната с лигиране PCR (LM-PCR) направи пробив в откриването на повредени нуклеотиди на ниво нуклеотидна разделителна способност (Denissenko et al., 1996). LM-PCR първоначално е разработен за геномно секвениране, включително откриване на места за метилиране на CpG, както и за in vivo отпечатване (Konishi et al., 1995; Mueller and Wold, 1989, 1991; Nomoto et al., 1995; Pfeifer et al 1989). Оттогава се прилага за анализ на местата на разцепване на нуклеази, например разграждане на микрококова нуклеаза или DNase I, за изследване на хроматин (Kato et al., 2000).

Протеиновият сегмент, кодиран от екзони 1 и 2, е уникален за Nth 1 на бозайници и съдържа ядрени и митохондориални сигнали за насочване и предполагаеми места за взаимодействие за други възстановяващи компоненти. Протеиновият сегмент, отговорен за бифункционалните ензимни дейности, активността на ДНК гликозилазата и активността на AP лиазата, се кодира от екзони 3 до 6. За да се определи молекулярният механизъм на ограниченото образуване на увредени нуклеотиди в екзони 1 до 4, ние анализирахме хроматиновата структура на черния дроб, бъбреците и далака при контролни плъхове. Нуклеозомите в екзони 1 до 4 на гена Nth 1 бяха лесно достъпни за MNase, особено в бъбреците. Това наблюдение може да даде индикация за чувствителност към бъбречна канцерогенеза.

Резултати

Регионално ограничено образуване на увредени нуклеотиди в Nth 1 гена

връзки

Разпределение на увредените нуклеотиди в Nth 1 гена. ( а ) Разпределението на разцепени от пиперидин или Fpg-усвоени сайтове върху геномна ДНК от бъбреците в определеното време след третиране с Fe-NTA или контролен бъбрек без лечение беше анализирано чрез LM-PCR. Геномната ДНК от бъбреците на контролните животни също реагира с DMS, след това се усвоява с пиперидин и се използва като гуанинова (G) стълба. Показани са профилите на разцепване на нетранскрибираната верига в екзон 1 на Nth 1 гена. "Txn" показва позицията на предварителна начална страница за транскрипция. ( б ) Разпределението на Fpg-усвоени сайтове върху геномна ДНК, както е описано по-горе. Показани са профилите на разцепване на нетранскрибираната верига в екзон 3 на Nth 1 гена. ( ° С ) Показано е разпределението на Fpg-усвоените сайтове върху нетранскрибираната верига в екзон 5 на Nth 1 гена

връзки

Обобщение на увредените нуклеотиди в Nth 1 гена. Сравняват се последователностите на мишка (M) и плъхове (R). Производните аминокиселини могат да се видят отгоре (мишка) и отдолу (плъх). Нуклеотидните различия между Nth-1 генни последователности на мишки и плъхове са посочени с обърнати (запълнени квадратни) черни букви. Предполагаемите аминокиселинни замествания също са обозначени с обърнати (запълнени квадратни) черни букви. Повредените нуклеотиди в Nth-1 гена на плъх са показани в червено; Обърнатите (запълнени квадратни) червени букви означават повредени нуклеотиди, които са били открити върху нетранскрибираната верига, докато квадратните червени букви означават тези, които са били открити върху транскрибираната верига. Подчертаването в екзон 1 показва предварителен митохондриален целеви сигнал, докато това в екзон 2 показва предполагаем сигнал за локализация на ядрата. Квадратът Lys в екзон 4 показва активен център на активността на ДНК гликозилаза, докато квадратът Asp в екзон 5 показва активен център на активността на AP лиазата

Организация на хроматиновите структури в Nth 1 гена

увредени

Етидиев бромидно оцветяване на фрагменти, усвоени с микрококова нуклеаза (MNase). Хроматините, произведени от черен дроб, бъбреци и далак, се усвояват с MNase, както е посочено (U/ml), и след екстракция на ДНК, както е описано в Материали и методи, усвоените ДНК фрагменти се електрофорезират върху 1,5% агарозен гел

увредени

Анализ на местата на разцепване на микрококова нуклеаза (MNase) в Nth 1 гена. ДНК-фрагменти, смилани с микрококова нуклеаза, приготвени от черен дроб, бъбреци и далак, както е описано на фиг. 3, бяха анализирани чрез LM-PCR. Лентата с надпис "G-стълба" представлява гуаниновата стълба, както е описано на фигура 1. Очакваното положение на нуклеозомната фаза е показано в дясната страна на панела. ( а ) Разпределение на места, разцепени от микрококова нуклеаза в екзон 1 на гена Nth 1. "Txn" указва позицията на начален сайт за предварителна транскрипция. ( б ) Разпределение на тези в екзон 3 на Nth 1 гена. ( ° С ) Разпределение на тези в екзон 5 на Nth 1 гена

дискусия

Протеиновият сегмент, кодиран от екзони 1 и 2, е уникален за Nth 1 на бозайници и се смята, че съдържа ядрени и митохондриални целеви сигнали и места за взаимодействие за други компоненти на възстановителната система (Ikeda et al., 1998). Наскоро Klungland et al. (1999) показват, че протеинът XPG активира човешкия и S. pombe Nth 1 и стимулира свързването на Nth 1 протеин с ДНК, съдържаща лезии, чрез индиректно взаимодействие между Nth 1 и XPG. Не се наблюдава активиране или стимулация от XPG за E. coli Nth 1. Следователно мутациите в тези региони могат да доведат до ненормална вътреклетъчна локализация на мутиралия Nth 1 протеин или разстройство.

Материали и методи

Животни

Шестседмични мъжки плъхове Wistar са закупени от Seiwa Experimental Animal (Fukuoka, Япония). Те бяха снабдени с търговска налична чау-чау (Clea, Токио, Япония) и вода от чешмата ad libitum и използвани след 4 дни аклиматизация.

Химикали и Fpg

Fe (NO 3) 3, Na2 NTA и ДНК екстрактор WB Kit са закупени от Wako Biochemicals (Осака, Япония). Пиперидин и диметил сулфат (DMS) са от Nacalai Tesque (Киото, Япония). Разтворът на железен нитрилоацетат (Fe-NTA) беше непосредствено преди употреба съгласно методите на Awai et al. (1979) с малка модификация. Накратко, Fe (NO 3) 3 и Na 2 NTA се разтварят във вода Milli-Q и след това се смесват при моларно съотношение 1: 4. РН се регулира до 7.4 с NaHC03. Fpg е получен от Trevigen (Каталожен номер 4040-100-01). Геномната ДНК се усвоява с Fpg съгласно инструкциите на производителя.

Лечение с Fe-NTA

Общо 30 животни бяха разделени на Fe-NTA и контролни групи. В групата на Fe-NTA те бяха убити 1, 6, 24, 72 и 120 часа след инжектиране на Fe-NTA (15 mg Fe/kg телесно тегло ip). В контролната група те бяха убити без лечение. Всяка подгрупа съдържа пет животни. Животните бяха умъртвени под етерна анестезия. Бъбреците бяха отстранени незабавно и след това използвани за експериментите. Част от органа беше замразена и държана при -80 ° C.

Лигирана-медиирана PCR (LM-PCR)

ДНК се извлича от бъбреците на плъхове (100-200 mg), като се използва ДНК екстрактор WB комплект съгласно метода на Nakae et al. (1995). Екстрахираната ДНК се усвоява с Fpg, както е описано по-горе, или се усвоява с 1 М пиперидин в продължение на 30 минути при 90 ° С (Maxam и Gilbert, 1977). Fpg ензимът разпознава формамид пиримидини, получени от аденин, гуанин или 8-OH-гуа, както и някои окислени пиримидинови продукти като 5-хидроксицитозин и 5-хидроксиурацил (Tchou et al., 1994). От друга страна, химическият реагент пиперидин може да разцепи много видове нуклеотидни производни, включително 8-OH-Gua и сродни съединения (Chung et al., 1992), както и различни видове производни, получени чрез химични реакции от Maxam и Gilbert. Като контролна гуанинова стълба, аликвотна част от геномна ДНК от контролни животни реагира с DMS и се разцепва с пиперидин, както е описано по-горе. LM-PCR се извършва, както е описано по-рано (Konishi et al., 1995; Nomoto et al., 1995). Нуклеотидните позиции на сигналите за разцепване, получени от LM-PCR продукти, бяха определени от контролната гуанинова стълба и информацията за последователността на Nth-1 гена на плъх.

Информацията за последователността за плъх Nth-1 cDNA обхваща само 3'-329 bp фрагмент (GenBank H33255). Nth-1 генната последователност на плъх, необходима за проектиране на праймери за LM-PCR, е получена от геномни PCR продукти на плъхове, амплифицирани с праймери, базирани на нуклеотидни участъци между Nth-1 кДНК са били запазени при мишки и хора (Aspinwall et al., 1997; Hilbert et al. 1997). Нуклеотидните последователности на отделните LM-PCR праймери са както следва. За екзон 1 на Nth 1 гена: праймер 1, 5'-gcctggagctaaagttccacg-3 '; Грунд 2, 5'-cccctgcaggcgcagcg-3 '; Праймер 3, 5'-ccctgcaggcgcagcgctacCTGC (главни букви показват последователността на екзона). За екзон 3: праймер 1, 5'-gtagtcagagatgcctgcctc-3 '; Грунд 2, 5'-ctccagaacagtgccccctcttgg-3 '; Грунд 3, 5'-ccagaacagtgccccctcttggttctgttgcc-3 '. За екзон 5: грунд 1, 5'-Cagcaggatacctctctccc-3 '; Грунд 2, 5'-CaccaagctacactacCTGGGTAGCC-3 '; Грунд 3, 5'-ccaagctacactacCTGGGTAGCCACTCTTCCAGG-3 '. Праймери 1 и 2 бяха използвани съответно за синтеза на първата верига и PCR амплификацията. Праймери 3 бяха маркирани в 5 'края с γ- 32 P-ATP и използвани за окончателно откриване на стълбата.

Храносмилане с микрококови нуклеази

Хроматиновите фракции от черен дроб, бъбреци и далак от контролни плъхове се приготвят, както е описано (Gorsky et al., 1986; Goldhamer et al., 1995). Хроматинова суспензия в буфер за смилане, 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,5 mM DTT, 0,15 mM спермидин, 0,34 mM захароза, 0,1 mM PMSF и mM M CaCl2 се усвоява със серийни разреждания на микрококова нуклеаза (Worthington Biochemical Corp.) при 20 ° С в продължение на 5 минути. След екстракцията на ДНК, описана по-горе, 5-краищата на разцепените от MNase места бяха фосфорилирани с Т4 полинуклеотид киназа и студен ATP (McPherson et al., 1993; Truss et al., 1995). Електрофорезата на извлечената ДНК се извършва върху 1,5% агарозен гел. ДНК пробите се подлагат на LM-PCR, както е описано по-горе.

Денят на благодарността

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства за изследване на рака от японското министерство на образованието, културата, спорта, науката и технологиите и Раковото общество на Фукуока, Фукуока, Япония.