Влиянието на тъканните макрофаги върху метаболитните заболявания - PDF безплатно изтегляне

1 Влиянието на тъканните макрофаги върху метаболитните болести МАГИСТЪРСКА ТЕЗА за придобиване на академична степен магистър по наука в Хамбургския университет за приложни науки Факултет Науки за живота Биотехнология проф. Д-р. Оливър Улрих д-р Андре Броерман, представено от: Кристиан Дикел, вторник, 13 ноември 2012 г.

2 Хамбургски университет за приложни науки Факултет по природни науки Катедра по биотехнологии Lohbrügger Kirchstrasse Hamburg в сътрудничество с: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Birkendorfer Strasse Biberach an der Riss Автор: Christiane Dickel Дата на подаване: Първи изпитващ: Втори изпитващ: Проф. Д-р. Оливър Улрих д-р Андре Броерман

3 Съдържание 1. Въведение. VI 1.1 Затлъстяване и инсулинова резистентност. VI 1.2 Еволюционна перспектива. VIII 1.3 Макрофаги при метаболитни заболявания. X подтипа на макрофагите. X Трансендотелна миграция на макрофаги. XIII Роля на CCR2 и MCP-1 при набирането на макрофаги. XIII 1.4 Маркери на белите кръвни клетки за FACS анализ. XV 1.5 животински модели. XVI Об/об мишка. XVI. Db/db мишката. XVII DIO мишка. XVII 1.6 Възможности за лечение на диабет тип II. XVIII 1.7 Цел. XXII 2. Материали и методи. XXIII 2.1 Материали. XXIII консумативи. XXIII Използвано оборудване. XXIII химикали. XXIV антитела. XXVI смеси за фуражи за животни. XXVI 2.2 Методи. XXVII тъканна подготовка. XXVII клетъчна изолация. XXVII брой клетки. XXVII имунофлуоресцентно оцветяване. XXVIII Флуоресцентно активиран клетъчен сортировъчен анализ (FACS). XXIX III

4 2.2.6 Оценка. XXX тест за толерантност към инсулин (ITT). XXXI Тест за орална толерантност към глюкоза (ogtt). XXXII анализ на цитокини. XXXII животни. XXXIII статистика. XXXIII 3. Резултати. XXXIV 3.1 Създаване на стратегия за обработка на миша, епидидимална мастна тъкан за FACS анализ на банкомати. XXXIV 3.2 Установяване на FACS метод за количествен анализ на левкоцитите. Тандем панел XXXV (панел за 4 души). XXXV анализи с 3-кратно оцветяване. XXXVI комбинационен панел (панел от 4). Тест XLI 3.3 на системата. XLIV левкоцити в генетичен модел на диабет. Сравнение на XLIV метода. XLIV анализ с 3 панела. XLVII анализ с комбинирания панел. LI резултат сравнение. LII левкоцити в диабет модел на диабет. LIII 3.4 Субхронично проучване на CCR2 антагонист при мишки huccr2. LVI левкоцити. LVI кръвна плазмена концентрация на MCP-1. LXII метаболитни параметри. LXIII 4. Дискусия. LXV 4.1 Създаване на FACS анализ за количествено определяне на общите и провъзпалителни макрофаги в миша мастна тъкан. LXV тандемен панел. Комбиниран панел LXV. LXV тройно оцветяване. LXVI M1/M2 панел. LXVI IV

5 4.2 Сравнение на методите. LXVII 4.3 Генетични модели мишки. LXVIII 4.4 Моделът, предизвикан от диета (DIO). LXX 4.5 Сравнение на моделите за затлъстяване. LXXI 4.6 Повишен брой ATM при затлъстели мишки. LXXII 4.7 CCR2 антагонизъм като терапевтична възможност за диабет тип II. LXXIII ATM номера преди третиране на вещества. LXXIII Противовъзпалителен ефект на пиоглитазон в модела DIO. LXXIV CCR2 антагонизъм без противовъзпалителен ефект в мастната тъкан на тестисите. LXXIV Връзка между възпалението на мастната тъкан и метаболитните параметри в този експеримент. LXXV 5. Outlook. LXXVI 6. Резюме. LXXVII 7. Списък на съкращенията. LXXVIII 8. Списък на фигурите. LXXXI 9. Списък на таблици. LXXXIV 10. Библиография. LXXXV 11. Приложение. LXXXIX 11.1 Листове с данни за фуражни смеси. LXXXIX информационен лист на фуража във фермата. LXXXIX лист с данни за диетата с високо съдържание на мазнини. XC лист с данни за нормалната диета. XCI 11.2 FACS протокол на Dr. Чавакис в ТУ Дрезден. XCII клетвена декларация. XCVII благодаря. XCVIII V

9 1. Въведение Фигура 2: Развитие на мастната тъкан, черния дроб и хематопоетичната система в отделни органи при бозайници При Drosophila melanogaster мастната тъкан, черният дроб и хематопоетичната система се комбинират във функционална единица, наречена мастното тяло. Този произход на развитието се отразява в подобната структура на хомолозите на бозайниците. Ефектите на адипоцитите в мастната тъкан и хепатоцитите в черния дроб върху съответните имунни клетки, макрофаги и Kupffer клетки, са много сходни. Освен това има тясна връзка между реакциите на имунната система и метаболитната система, което се отразява в директния достъп на двете тъкани до мрежата на кръвоносните съдове. (Hotamisligil, 2006) 9

10 1. Въведение 1.3 Макрофаги при метаболитни заболявания Подтипове на макрофаги През 2003 г. за първи път беше публикувана връзка между свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност и хроничното възпаление в мастната тъкан, изразена под формата на натрупване на макрофаги в бяла мастна тъкан (Weisberg et al., 2003; Xu et al., 2003). Макрофагите са диференцирани моноцити, които се развиват от предшественици на гръбначния мозък. Следователно те принадлежат към циркулиращите бели кръвни клетки. Както моноцитите, така и макрофагите са разнородни клетъчни популации. Първоначално бяха дефинирани два подтипа на макрофагите: класически активираните провъзпалителни M1 макрофаги и алтернативно активираните M2 макрофаги (Gutierrez et al., 2009; Schipper et al., 2010). При бозайниците с нормално тегло левкоцитите се намират в мастната тъкан, черния дроб, мускулите и панкреаса. Техният фенотип съответства на този на М2 макрофагите, които участват в тъканната хомеостаза (Lumeng et al., 2007c; Lumeng et al., 2008; Odegaard et al., 2008; Olefsky & Glass, 2010; Lumeng et al., 2007b). По този начин те секретират противовъзпалителни цитокини като интерлевкин (IL) -10, IL-4 и IL-13 (фиг. 3). 10

11 1. Въведение Фигура 3: Поляризация на макрофагите при индуцирана от затлъстяване инсулинова резистентност в мастната тъкан При нормални условия на тегло адипоцитите секретират фактори като интерлевкин (IL) -13, който предизвиква алтернативно активиране на макрофаги. Алтернативно активираните (М2) макрофаги секретират противовъзпалителни медиатори като IL-10. Тези противовъзпалителни цитокини имат положителен ефект върху инсулиновата чувствителност. Затлъстяването предизвиква промени в метаболизма на адипоцитите и в генната експресия на цитокини. Това води до повишена липолиза и освобождаване на възпалителни свободни мастни киселини (ffas) и фактори, които набират и активират макрофагите. Такива фактори са моноцитният хемотаксичен протеин-1 (MCP-1) и туморният некротизиращ фактор α (TNFα). Класически активираните M1 макрофаги произвеждат големи количества провъзпалителни медиатори, като TNFα, IL-1β и резистин, които действат върху адипоцитите и по този начин индуцират инсулинова резистентност. По този начин се създава самоукрепващ се порочен кръг, който допълнително увеличава възпалението и резистентността към инсулин. (Olefsky & Glass, 2010; Фигура 2, стр. 223) 11

23 2. Материали и методи 2. Материали и методи 2.1 Материали Консумативи Описание Производител # Продукт №. Ръкавици нитрил Kimberly-Clark # 90627 Микрореакционни тръби eppendorf # Епруветки за безопасно заключване (0,5, 1,5, 2,0 ml) eppendorf # eppendorf # Накрайници за пипети eppendorf # (20, 200, 1000, 5000 µl) eppendorf # eppendorf # eppendorf # Матрични накрайници за пипети Thermo Scientific # 7281 Еднократни пипети резервоар за реагент costar VWR # Центрифужна епруветка (15, 50 ml) зърно # 188271, ml-епруветки BD Falcon # кладенец с дълбоко кръгло дъно BD Falcon # Петри Dish BD Falcon # Еднократни камери за преброяване на клетки инвотроген # 10283 Smart глюкоза за кръв инсутроген # 10283 Кръвен глюкозен тест # Глюкоза на кръвта Глюкоза за кръв # 10283 Zellstrayner Fisherbrand # Използвани устройства Обозначение Име на продукта Производител Аналитични везни AC211S Сарториус везни A30 Mettler инкубатор BBD 6220 Heraeus накланящ се шейкър PTR-30 Grant-bio Хладилна центрофуга Heraeus Megafuge 40R Thermo Scientific пипети 2, 10, 20, 100, 200, 1000, 5000 µ

24 2. Материали и методи Матрични пипети 1250 Matrix Impact 2 Thermo Scientific помощно средство за пипетиране ac-jet BRAND предпазни шкафове Hera Safe Thermo Scientific настолна центрофуга 5417C eppendorf Vortexer VF2 Janke & Kunkel клетъчен брояч Графиня инвитроген Флуоресценция активиран клетъчен сортиращ MACS Quant Miltenyi Биотехн Биотехнология Биотех Механизъм за измерване на кръвна захар Биотех Механизъм за измерване на кръвна захар Биотехнологичен индикатор за кръвна захар Cobas Integra 400 plus Roche химикали наименование Bacillol plus Производител # Продукт №. BODE RPMI 1640 с глутамин Lonza # 4464 Фетален говежди серум Биологични индустрии # 04-001AUS-1A Dulbecco s Phophate буфериран физиологичен разтвор Lonza # 6716 Collagenase Sigma # C0130 Trypan blue invitrogen # T10282 Работещ буфер MACS Buffer Buffer Solution MACS Buffer MACS Buffer MACS Buffer MACS Buffer Solution MACS Buffer MACS Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS MACS Buffer Solution MACS Buffer MACS Разтвор за избелване MACS буфер # амониев хлорид EDTA Sgima AG Sigma #EG калиев хидроген карбонат натриев хлорид MERCK # калиев хлорид MERCK # динатриев хидроген фосфат MERCK # магнезиев сулфат MERCK #

25 2. Материали и методи Калциев хлорид Sigma #CG Калиев дихидроген водороден фосфат MERCK # Hepes Fluka # 54466 Натриев хидрогенкарбонат MERCK # Глюкоза Sigma-Aldrich # 15,896-8 Pioglitazon CCR2 антагонист Takeda произведен вътрешно Хемолиза буфер 150COCOCO 4 Cl 250 µH ED ED: Разтвор 1 (4 пъти) 137 mm NaCl 5,36 mm KCl 0,34 mm Na2HPO4 0,81 mm MgSO4 1,26 mm CaCl2 0,44 mm KH2HPO4 Разтвор 2 (4 пъти) 10 mm Hepes 4,17 mm NaHCO3 Смесете по 1 част от разтвори 1 и 2 с 2 части двойно дестилирана вода и регулирайте рН до 7,3 с NaOH при температура на разтвора 4 ° С. 25-ти

26 2. Материали и методи Антитела Обозначение Производител # Продукт №. PE Плъх Anti-Mouse CD45 BD Pharmingen # PE Плъх IgG2b, κ Isotype Control BD Pharmingen # APC Плъх Anti-Mouse CD11b BD Pharmingen # APC Плъх IgG2b, κ Isotype Control BD Pharmingen # PE-Cy 7 Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # PE-Cy 7 Hamster IgG1, λ1 Isotype Control BD Pharmingen # PE Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # PE Hamster IgG1, λ1 Isotype Control BD Pharmingen # FITC Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # FITC Hamster IgG1, λ1 Isotype Control BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Плъх Anti-Mouse CD45 BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Плъх IgG2b, κ Isotype Control BD Pharmingen # Плъх Anti-Mouse F4/80 Антиген: FITC Плъх IgG2b Отрицателен контрол: FITC AbDserotec # MCA497FB abdserotec # MCA1125FT FC Block -Мишка CD16/CD32 BD Pharmingen # Смеси за фуражи за животни Поддържане на фураж Kliba Nafag #% kcal диета с високо съдържание на мазнини Изследователски диети # D% kcal Контролна диета Изследователски диети # D12450B Съответните информационни листове за фуражните смеси могат да бъдат намерени в приложението (раздел 11.1). 26-ти

31 2. Материали и методи Изчисляване на концентрацията на АТМ в мастната тъкан: Изчисляване на процента на макрофагите в SVF: Тест за инсулинова толерантност (ITT) Тестът за инсулинова толерантност (ITT) се нарича още тест за инсулинова хипогликемия и се използва за откриване на инсулинова резистентност. След инжектиране на инсулин се наблюдава значително намаляване на концентрацията на кръвната захар в здрав организъм. Ако има инсулинова резистентност, спадът на кръвната глюкоза в отговор на приложението на инсулин се намалява. Животните се гладуват два часа преди началото на експеримента. След тези два часа, непосредствено преди приложението на инсулин, се приема стойността на гладно. Инсулиновият разтвор се дава ip на животните. приложени (напр. 0,5 IU/kg). По време на 10, 20 и 120 минути след прилагането на инсулина, нивото на кръвната захар на животните се измерва с ленти за измерване на кръвната захар и измервателно устройство от Gluko Smart Swing. Това се прави с помощта на капилярна кръв от върха на опашката. 31

33 2. Материали и методи Животни Всички експерименти с животни са проведени съгласно указанията на Регионалния съвет на Тюбинген. Мишките бяха настанени в среда без патогени при стандартен светлинен цикъл (12 часа светлина/тъмнина) със свободен достъп до вода и храна. Животните бяха поръчани от Янвиер. В този проект се използва диета с високо съдържание на мазнини, за да се предизвика инсулинова резистентност. За тази цел на мишките C57BL/6J беше дадена диетата D12451 (20% kcal протеин, 35% kcal въглехидрати, 45% kcal мазнини) и съответната контролна диета D12450B (20% kcal протеин, 70% kcal въглехидрати, 10% kcal мазнини) от Research Diets захранвани със същото количество ккал в общата статистика Статистическият анализ е извършен със софтуера Prism Версия 5.0 за Windows от Graphpad. T-тестът беше използван за сравняване на две групи. За групов анализ с повече от две групи анализът се извършва с помощта на ANOVA и теста на Dunnett. Стойностите на Р от 0,05 се считат за значими. Значимостта е идентифицирана по следния начин: * съответства на p 0,05, ** съответства на p 0,01 и *** съответства на p 0,

37 3. Резултати A B C Фигура 8: Контрол на изотипа на панела на макрофагите с плъх IgG2b κ-pe, плъх IgG2b-FITC и плъх IgG2b κ-apc A В точковото петно на SSC срещу FSC е дефинирана порта P1 (червена), която показва SVF. B PE и FITC сигналите от този P1 порта се анализират допълнително в точковото петно. Различна популация, която е положителна и за двата етикета, се определя като CD45 + F4/80 + (зелено). C Тези двойно положителни клетки са нанесени срещу техния APC сигнал в хистограмата и положителният сигнал (розов) показва тройно положителните макрофаги на SVF. Определена е специфична CD45 + F4/80 + клетъчна популация (ФИГ. 7В). Двойно положителните клетки се изследват в APC канала за специфичния CD11b положителен сигнал (ФИГ. 7С). Тези тройно положителни клетки са макрофаги. Съответният контрол на изотипа показва, както се очаква, само много нисък неспецифичен сигнал както за точковото петно PE/FITC (ФИГ. 8В), така и за APC хистограмата (ФИГ. 8С). 37

39 3. Резултати ABCD Фигура 10: Контрол на изотипа на провоспалителния макрофагичен панел с плъх IgG2b κ-PE, плъх IgG2b κ-apc и Hamster IgG1 λ1-fitc A В точковото петно на SSC срещу FSC се определя порта P1 (червен), който е SVF карти. B PE сигналът на този P1 порта се анализира допълнително в точковото петно. CD45 положителните клетки (сини) са затворени и C е показано в хистограмата срещу техния APC сигнал. След това положителният сигнал (розов) се затваря D по отношение на FITC сигнала. По този начин могат да се анализират тройно-положителните проинфламаторни макрофаги на SVF (зелено). PE сигналът на анти-cd45 антитялото показва облаци от две точки, които могат да бъдат ясно разграничени един от друг (фиг. 9В). Два ясно дефинирани пика могат да се видят и в хистограмата на APC (фиг. 9C). При контрола на изотипа не съществуват неспецифични свързвания и в двата канала (ФИГ. 10В и 10С). Обаче двойно положителните клетки показват висок фонов шум за емисията на флуоресценция във FITC канала (ФИГ. 9D). Всички неспецифични сигнали обаче могат да бъдат изключени чрез зададената порта (Фиг. 10D). 39

41 3. Резултати F4/80 + CD11b + клетките образуват отделна клетъчна популация в диаграмата FITC/APC (ФИГ. 11В). Тези двойно положителни макрофаги също образуват отрицателен и положителен сигнал в PE хистограмата (ФИГ. 11С). Както в портата на макрофага, така и в затворените CD11c + клетки са за контрол на изотипа без сигнал (фиг. 12В и 12С). Комбиниран панел (панел от 4) Тъй като анализът на четирите клетъчни маркера в панела на антителата има големи предимства като по-ниска консумация на антитела и по-малко време, отколкото при анализът на две 3-кратно оцветяване на макрофага и провоспалителния панел на макрофаги означава, че панелът с F4/80-FITC, CD11b-APC и CD11c-PE е разширен с анти-CD45 антитяло с етикет Alexa Fluor 700. Фиг. 13 показва емисионните спектри на използваните четири етикета. Комбинацията от тези флуорохроми трябва да бъде възможна, тъй като емисионните спектри не се припокриват в своите максимуми. Фигура 13: Флуоресцентни спектри на комбинирания панел (панел от 4) с FITC, PE, APC и Alexa Fluor700 41

42 3. Резултати Получената структура на затвора за анализ на макрофагите и проинфламаторните макрофаги е показана по-долу (фиг. 14). Съответният контрол на изотипа може да се види на фиг. 15. A B C D Фигура 14: Порти на 4-пътния панел на антитела с CD45-Alexa700, F4/80-FITC, CD11b-APC и CD11c-PE A В точковото петно на SSC срещу FSC е дефиниран портал P1 (червен), който представлява SVF. B Alexa Fluor700 и FITC сигнали от този P1 порта се анализират допълнително в точковото петно. Различна положителна популация и за двата етикета се определя като CD45 + F4/80 + (синьо). Тези двойно положителни клетки се нанасят срещу техния APC сигнал в хистограмата C. и положителният сигнал (розов) представлява тройно положителните макрофаги на SVF. Тези макрофаги се изследват за техния PE сигнал в следваща хистограма. CD11c положителните възпалителни макрофаги на SVF, затворени през зелената порта, могат да бъдат свързани директно с макрофагите на SVF от същата проба при едно измерване. 42