Влиянието на пренаталния стрес върху миелинизацията и формирането на невронната мрежа
Влиянието на пренаталния стрес върху миелинизацията и формирането на невронната мрежа в мозъка на феталната овца Дисертация за получаване на академична степен лекар medicinae (д-р мед), представена на Съвета на Медицинския факултет на университета „Фридрих Шилер“ Йена от Джулия Куенд, родена на 5 септември 1987 г. в Гота
Рецензент: 1. проф. Д-р мед. Матиас Шваб/Йена 2. Проф. Д-р мед. Ричард Бергер/Нойвид 3. PD Dr. мед. Ден на обществената защита на Бернд Ромейке/Йена: 6 май 2014 г.
Съдържание Съдържание СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА 1 1 РЕЗЮМЕ 1 2 ВЪВЕДЕНИЕ 3 2.1 Клинично значение на пренаталния стрес за плода 3 2.2 Развитие на мозъка на плода 5 2.2.1 Развитие на мозъка на ембриона 5 2.2.2 Размножаване и миграция на клетки 5 2.2.3 Невронална и глиална диференциация 6 2.2.4 Церебрална миеребрация 7 2.2.4.1 Структура и биохимичен състав на миелиновата обвивка 7 2.2.4.2 Функция и значение на миелиновата обвивка 9 2.2.4.3 Произход и диференциация на олигодендроцитите 10 2.2.4.4 Времеви ход на миелинизация 11 2.3 Ефекти от пренаталния стрес върху развитието на мозъка на плода 13 2.3.1 Мозъчни ефекти от майчин стрес 13 2.3.2 Мозъчни ефекти от пренатална глюкокортикоидна терапия 14 2.3.3 Регулиране на оста на стреса 16 2.3.4 Ефекти от майчин стрес и пренатална глюкокортикоидна терапия върху развитието на стресовата ос 18 2.4 Механизми на ефектите от пренаталния стрес 19 2.4.1 Предаване на майката Стрес върху плодовете 19 2.4.2 Рецепторно-медиирани ефекти на глюкокортикоидите 20 2.4.3 Пренатален стрес и хормони на растежа 21 2.5 Цел на работата 22
Съдържание 3 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ 25 3.1 Експеримент 25 3.1.1 Експериментален протокол 25 3.1.2 Получаване на мозъка на плода и вземане на пробите 27 3.2 Хистохимично и имунохистохимично оцветяване 28 3.2.1 Преглед на оцветяване с хематоксилин-еозин 28 3.2.2 Импрегниране със сребро според Bielschowsky 29 3.2.3 Имунохистохимично откриване на MBP 31 3.3 Светлинна микроскопия и PC-асистирана оценка 35 3.4 Статистическа оценка 39 4 РЕЗУЛТАТИ 40 4.1 Телесно тегло и мозъчно тегло след пренатален стрес 40 4.2 Мозъчни ефекти от пренатален стрес 42 4.2.1 Образуване на невронални процеси в бялото вещество 42 4.2.1.1 Подкорково бяло вещество 42 4.2.1.2 Corpus callosum 47 4.2.1.3 Дълбоко бяло вещество corona radiata 49 4.2.1.4 Вътрешна капсула 51 4.2.2 Миелинизация на невронални процеси в бялото вещество 53 4.2.2.1 Подкорково бяло вещество 53 4.2.2.2 Корпус callosum 58 4.2.2.3 Наситено бяло вещество - Corona radiata 60 4.2.2.4 Capsula interna 62 4.2.3 Форма Образуване на невронални структури в хипокампуса (CA3 регион) 64
Съдържание 5 ДИСКУСИЯ 69 5.1 Дискусия на методи 69 5.1.1 Животински модел 69 5.1.2 Модел на стрес 70 5.1.3 Хистология 72 5.1.4 Количествен анализ на изображението 74 5.2 Дискусия на резултатите 75 5.2.1 Пренатален стрес и растеж на плода 75 5.2.2 Ефекти от пренаталния стрес върху хипокампуса 78 5.2.3 Церебрални ефекти след пренатален стрес върху невронната мрежа 79 5.2.4 Церебрални ефекти след пренатален стрес върху миелинизация 82 6 ЗАКЛЮЧЕНИЯ 84 7 ЛИТЕРАТУРА И РЕФЕРЕНЦИИ 86 8 ПРИЛОЖЕНИЕ 102 8.1 Благодарности 102 8.2 Почетна декларация 103
Списък на съкращенията Списък на съкращенията ABC ACTH ADHD AK AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN ос 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidin-Biotin-Complex Адренокортикотропен хормон Разстройство на вниманието/хиперактивност Работен буфер на антитела Работен буфер + Triton-X-100 работен буфер + Triton + Serum Aqua destillata (дестилирана вода) аргинин-вазопресин бетаметазон 2-3-Цикличен нуклеотид 3-фосфохидролаза (плацентарен) кортикотропин-освобождаващ хормон глюкокортикоидни рецепторни гестационни дни хематоксилин-еозин хипоталамус-хипофиза-хипофиза-хипофиза-хипофиза Хидроксистероидна дехидрогеназа тип 2 Инсулиноподобен растежен фактор Миелин асоцииран гликопротеин Миелин основен протеин Миелин/олигодендроцит гликопротеин Минералокортикоиден рецептор Средна стойност Олигодендроцитен миелин протеин Фосфатен буфер Протеолипиден протеин Стайна температура Стандартна грешка на средната стойност
2 Индукция на первентрикуларна левкомалация (увреждане на бялото вещество по време на преждевременно раждане) около времето от 0,65 бременност (съответстващо на 24-28-та гестационна седмица в човешкия плод), висока степен на сравнимост на мозъчното развитие между феталните овце и хората. Това се подкрепя от факта, че в този времеви прозорец започва съзряването на олигодендроцитите във феталния мозък на овцете и в същото време при недоносени бебета може да се наблюдава висок риск от увреждане на незрелото, перивентрикуларно бяло вещество (Back et al. 2006, 2001) . По време на раждането мозъкът на създадения човек показва малко по-висока степен на зрялост от тази на хората (McIntosh et al. 1979, Astrom 1967). Това може да предполага, че творческият ум съзрява по-бързо през последния триместър. 12
2 Въведение координиран физиологичен отговор на различни концентрации на кортизол (глава 2.4.2). Фиг.2.3: Хипоталамус-хипофиза-надбъбречна ос и пътища на отрицателна обратна връзка. Кортикотропин освобождаващ хормон (CRH), аргинин вазопресин (AVP), проопиомеланокортин (POMC), адренокортикотропен хормон (ACTH), паравентрикуларно ядро (NPV). Променено от Metthews 2002. 17
2 Въведение показва времеви ход на развитие на мозъка, подобен на този на хората, дори ако той узрява малко по-бързо. Общо бяха оценени мозъците на 45 работници, които бяха хронично стресирани между 0,20-0,66 бременност (30-100-та GT) чрез 180-минутна изолация два дни в седмицата. Тъй като овцете са стадни животни, изолацията е основен стрес за този вид. За да се покажат възможни трайни ефекти, мозъците бяха оценени по време на 0.73 (110-та GT, продължителност на бременността 150 дни) и 0,86 от бременността (130-та GT). Резултатите имат за цел да помогнат за изясняване на ефектите от пренаталния стрес върху мозъчната функция в по-късен живот. 24
3 Материали и методи Изолирани в близост до други животни, така че в края на протокола всяко животно е било изложено на индивидуална изолация 20 пъти. Тъй като овцете са стадни животни, те са особено чувствителни към този стрес. Измерванията на нивото на кортизол преди и по време на изолацията успяха да потвърдят този ефект (Rakers et al. 2012). Стресова група Контролна група Синхронизация на цикъла на еструса и планирано чифтосване Сравнение Подходящо отглеждане при овчарите Транспорт на бременни животни до лаборатория за изпитване Стрес чрез изолиране 2 пъти седмично в продължение на 3 часа Хронична апаратура Получаване на мозъка на плода - Група 1 Получаване на мозъка на плода - Група 2 Естествен срок на фиг. .3.1: Експериментален протокол Между 100-та и 110-та GT, плодовете са инструментирани с помощта на катетри, които са били използвани за проверка на вътреутробните стресови реакции (освобождаване на ACTH и кортизол). Тяхната оценка не е предмет на тази работа (вж. Rakers 2012). След приключване на експериментите и оперативното развитие на плодовете се определя теглото на тялото и мозъка. Тези измервания са направени на 26
3 Материал и методи за възходяща алкохолна серия, дехидратирана и затворена с монтажна среда Neo-Mount (MERCK GmbH, Дармщат, Германия). Подробният протокол на оцветяването може да бъде намерен в таблица 3.2. Средно обезпаразитяване: 2x Neoclear 2x изопропанол 100% 1x изопропанол 80% 1x изопропанол 50% дестилирана вода. Импрегнация със сребро: AgNO 3 20% 2x аква дест. Амонячен разтвор на сребърен нитрат дестилирана вода + nh 3 (4: 1) Na тиосулфат 5% дестилирана вода от чешмата. Дехидратация: Изопропанол 50% Изопропанол 80% 2x Изопропанол 100% 2x Неоклеарно включване на балсам с Entellan Време [мин]/Температура [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90/37 30/45 1- 3/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Таблица 3.2: Протокол за импрегниране със сребро съгласно Bielschowsky. RT стайна температура. Разтворите се приготвят, както следва: 20% разтвор на сребърен нитрат (AgNO 3): 100 ml дестилирана вода. + 20 g сребърен нитрат 5% натриев тиосулфат (Na2S2O3): 100 ml дестилирана вода. + 5 g натриев тиосулфат Приготвяне на разтвора за проявяване: 25 ml дестилирана вода. + 125 mg лимонена киселина (Fluka Chemie, Buchs, Германия) + 5 ml 36% формалин (Carl ROTH GmbH, Карлсруе, Германия) + 8 µl концентрирана азотна киселина-ENT 3 (Fluka Chemie, Buchs, Германия). 30-ти
3 Материал и методи 2xAP + T ABC комплекс: AP + T + разтворA + разтворB AP + T 2x PBS дестилирана вода. 3'3-диаминобензидин (DAB) 2x аква дест. Дехидратация: изопропанол 50% изопропанол 80% 2x изопропанол 100% 2x Neoclear 100% балсам включване с Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 20 μl всеки от разтвори А и В в 1 ml AP + T 1Set (H2O2 + DAB) за 5 ml дестилирана вода, филтрирайте с филтър Millipore Таблица 3.3: Протокол за имунохистиохимично откриване на MBP. Разтворите се приготвят, както следва: Цитратен буфер: 1 литър дестилирана вода. + 2,94 g натриев цитрат (Fluka Chemie, Buchs, Германия), рН 6,0. PBS: 1 литър дестилирана вода. + 1 g D-PBS работен буфер: 500 ml PBS + 2,5 g говежди серумен албумин (албумин от говежди серум, минимум 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Германия) + 250 µl TWEEN 20 (полиоксиетилен сорбитан монолаурат) (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Германия) ph 7.5. DAB разтвор (Sigma Fast DAB субстрат): 2 таблетки (урея водороден пероксид и 3,3-диаминобензидин) в 5 ml дестилирана вода. въртете се, докато готовите таблетки се разтворят напълно. 34
3 Материал и методи Фигура 3.3: Оцветяване с общ преглед на видоизменените модификации, съгласно The Sheep Brain Atlas, Michigan State Unversity Brain Biodiversity Bank, National Science Foundation. https://www.msu.edu/
мозъци/мозъци/овце/index.html, 15.02.2012. Вляво: Подкорково бяло вещество във фронталната кора: близо до кората [1] и далеч от кората [2]; Corpus callosum [3]; Corona radiata [4]; Вътрешна капсула [5]; SV: странична камера. Вдясно: CA3 регион в хипокампуса: вентрален участък [1], гръбен участък [2] 36
3 Материал и методи След цифровото съхранение записите се оценяват в програма за обработка на изображения (Scion Image 1.62 NIH, САЩ). Първо цветните изображения бяха преобразувани в черно-бели изображения с 256 нива на сивото. Площта на положителната маркировка в представителна секция беше определена чрез анализ на изображението. Областта на имуномаркировката/сребърната импрегнация отразява имунохистохимичното разпределение на антигена/плътността на клетъчните процеси. В сравнение с микроскопичното изображение, горната и долната прагова стойност бяха зададени под визуален контрол. Тези прагови стойности формират диапазон за селективно представяне на положителната MBP имунореактивност или сребърно оцветените нервни влакна. (виж фиг. 3.4, червена маркировка). Фиг. 3.4: Анализ на изображението с помощта на сиви стойности A: Микроскопско изображение: Невронални процеси в подкорковата бяла материя на фронталната кора, отдалечена от кората. 37
3 Материал и методи Б: Маркиране на оцветените разширения на клетки в изображението в сивата скала В сравнение с микроскопичното изображение, в изображението на сивата скала е дефинирана сива зона (маркирана в червено на изображението), което съответства на положителния сигнал от сребърната импрегнация. Тази площ се измерва от програмата за анализ на изображения. 38