Влиянието на мастоцита върху заздравяването на кожни рани Pseudomonas aeruginosa на инфектирани кожни рани

От Клиниката по дерматология, венерология и алергология на Медицинския факултет Charité Universitätsmedizin Berlin ДИСЕРТАЦИЯ Влиянието на мастоцитите върху заздравяването на кожни рани на кожни рани, заразени с Pseudomonas aeruginosa, за придобиване на академична степен Doctor medicinae (Dr. med.) Представено на Медицинския факултет Charité Universitätsmedizin Berlin Tröltzsch от Karl-Marx-Stadt/сега Chemnitz Дата на докторат: 04.09.2015-1 -

върху

Посветен на моите родители Рецензент: 1. 2. 3. Дата на докторат. - 2 -

Съдържание Резюме. Резюме. Поставяне на цели. 1. Въведение. 1 1.1. Основи на биологията на мастоцитите. 1 1.1.1. Въведение. 1 1.1.2. Характеристики на мастните клетки. 2 1.1.3. Модел на разпределение и хетерогенност. 3 1.1.4. Произход и развитие. 5 1.1.5. Физиология и функции на мастните клетки. 7 1.1.6. Имунологични компетенции на мастоцита. 11 1.2. Роля на мастоцитите в естествения имунитет срещу бактерии. 12 1.2.1. Общ. 12 1.2.2. Бактерията Pseudomonas aeruginosa. 14 1.2.3. Антимикробни пептиди и MZ протеази, както и тяхната роля в MZ-медиираната имунна защита. 15 1.3. Кожно заздравяване на рани. 16 1.3.1. Общ преглед. 16 1.3.2. Фази и механизми на зарастване на рани. 17 1.3.3. Заздравяване на рани и мастоцити - състояние на изследванията. 20 2. Материал и методи. 22 2.1. Животни. 22 2.1.1. Kit W/Kit W-v - модел на мишката. 22 2.1.2. Възстановяване. 23 2.2. Експеримент за заздравяване на рани с мишки от див тип и с дефицит на MZ. 23 2.2.1. Анестезия. 23 2.2.2. Раняване, инфекция и контрол. 23 iii

2.2.3. Измерване на рани. 24 2.2.4. Хистология. 25 2.3. Бактериално натоварване на раната. 26 2.4. Клетки. 27 2.4.1. Получаване и култивиране на култивирани MZ (BMCMC), получени от костен мозък. 27 2.4.2. Получаване на перитонеални мастни клетки (PMC). 28 2.4.3. Магнитно клетъчно разделяне (MACS). 28 2.4.4. Култивиране на PCMCs. 28 2.4.5. FACS анализ. 29 2.5. Култивиране на културата Pseudomonas aeruginosa. 30 2.6. β - анализ на хексозаминидаза. 30 2.7. Определяне на степента на бактериална преживяемост. 31 2.8. Цитоспин. 32 2.9. Количествена PCR в реално време (q-rt-pcr). 32 2.9.1. Грунд. 32 2.9.2. Стимулиране на PCMCs. 34 2.9.3. Изолация на РНК. 34 2.9.4. Определяне на чистотата и концентрацията на РНК. 35 2.9.5. Препишете в cdna. 35 2.9.6. PCR процедура с LightCycler. 36 2.10. Статистически анализ. 37 3. Резултати. 39 3.1. Курсът на зарастване на рани при мишки с дефицит на MZ Kit W/Kit W-v след инфекция с бактерията Pseudomonas aeruginosa се забавя. 39 3.2. Нормалното зарастване на рани на заразени с Pseudomonas aeruginosa рани зависи от мастоцитите. 43 3.3. Хистологично потвърждение на успешното възстановяване на MZ-дефицитен комплект W/Kit W-v - мишки с BMCMCs. 46 3.4. Животните с инфектирани с PA рани не показват системни признаци на инфекция. 49 iv

3.5. MZ намалява бактериалното натоварване на заразени с Pseudomonas aeruginosa рани. 51 3.6. Бактерията Pseudomonas aeruginosa и нейните компоненти не водят до дегранулация на култивирани перитонеални мастоцити (PCMC). 53 3.7. MCs намаляват степента на оцеляване на бактерията Pseudomonas aeruginosa в кокултурата. 55 3.8. Откриване на експресията на селекция от антимикробни пептиди и протеази, секретирани от MZ след стимулация с LPS и PA. 57 3.9. Pseudomonas aeruginosa и LPS променят експресията на MZ-специфични протеази и антимикробни пептиди в малка степен след 4 и 24 часа стимулация. 59 3.10. Култивирани перитонеални мастоцити като модел за кожни мастоцити. 61 4. Дискусия. 64 5. Библиография. 77 6. Декларация. 99 7. Автобиография. 100 8. Благодарности. 101 пр.н.е.

Цел in vivo: 1. Представяне на променената тенденция на заздравяване на рани от див тип Kit +/+ - и MZ-дефицитен Kit W/Kit Wv мишки след инфекция от бактерията Pseudomonas aeruginosa (pa) 2. Доказателства за MZ зависимостта на бактериалните заздравяващи нарушения чрез възстановяване дефицитни мишки, използващи BMCMCs 3. Сравнително определяне на бактериалния товар при рани на Kit +/+ - и Kit W/Kit Wv - мишки след 24 часа PA инфекция in vitro: 4. Изследване на активирането на MZ от PA, както и от избрани компоненти на тази бактерия 5. Количествено откриване на директното елиминиране на PA чрез MZ в съвместна култура 6. Идентифициране на секретирани антимикробни пептиди или протеази на MZ след бактериална стимулация и количествено определяне на експресията им чрез количествена PCR в реално време viii

Таблица 1 Свойства на миша лигавица и съединителна тъкан мастоцити (Galli, 1990) Мукоза MZ (MMC) Съединителна тъкан MZ (CTMC) Поява Бронхиален епител, чревна лигавица Кожа, бели дробове, перитонеум Продължителност на живота Около 40 дни Няколко месеца до години Ултраструктура на гранулите Малка, хетерогенна електронна плътност Голямо, хомогенно, електронно-плътно развитие Т-клетъчно зависими Да Не Най-известният интрагрануларен протеогликан Хондроитин сулфат Хепарин Може да бъде оцветено с Алцианско синьо Алцианско синьо, берберин сулфат, сафранин Съдържание на хистамин в гранулите Ниско високо съдържание на серотонин в гранулите Ниско променливо присъствие на Високо афинитетни Не80 рецептори Реагенти с висока афинитет Не80 Да, в рамките на популациите от човешки мастоцити се прави разлика по отношение на модела на експресия на триптаза и химаза, две добре известни протеази на мастоцитите. Триптаза- и химаза-позитивните клетки се намират в кожата, докато триптаза-положителните мастоцити доминират в белите дробове (Irani et al., 1986; Miller and Schwartz, 1989; Welle et al., 1997). - 4-ти -

PCR се оценява, като се използва относително количествено определяне на базата на β-актин като домакински ген, с който съотношението на стимулирана към нестимулирана проба (съотношение) може да се определи, като се използват следните формули: Съотношение = 2 -ΔΔCt ΔΔCt = ΔCt (стимулирано) - ΔCt нестимулиран) ΔCt = Ct (целеви ген) Ct (домакински ген). Стойността на Ct (праг на цикъла) описва цикъла на PCR, при който флуоресценцията се увеличава значително за първи път. 2.10 Статистически анализи Статистическата оценка на резултатите от тази работа е извършена по следния метод: Изчисляване на средната стойност M: M 1 nnxii 1 n Брой измерени стойности xi Стойност на измерената стойност i Стандартно отклонение SD на средната стойност: SD 1 n 1 nxi M i 1 2 Стандартна грешка SEM des Средна стойност: SD SEM n - 37 -

Всички набори от данни бяха анализирани за значимост, като се използва двустранен студентски t-тест за несвързани проби: Изчисляване на стойността: t M 2 1 1 1 SD n M 2 SD n 2 2 2 M 1: средна стойност на проба 1 M 2: средна стойност на проба 2 SD 1 Стандартно отклонение на средните стойности на популацията 1 SD 2 Стандартно отклонение на средните стойности на популацията 2 n 1 Брой измерени стойности в проба 1 n 2 Брой измерени стойности в проба 2 Стойност на вероятността ([p]) от p 0,05 като незначителна гледани. Всички данни бяха представени като средно ± SE. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на компютърния софтуер Statview (Statview за Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). - 38 -

Фигура 1a Kit +/+ (не заразени) 1,5 cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Kit +/+ (заразени) 1,5 cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Фигура 1b Kit W/Kit Wv (незаразени) 1,5 1,5 cm cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Kit W/Kit Wv (заразени) 1,5 1,5 cm cm 0h 6h 12h Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day8 Day9 Фигура 1 a/b: Раната на мишките с дефицит на MZ, заразени с Pseudomonas aeruginosa, е увеличена. Тези рани са заразени с 10 μl суспензия на Pseudomonas aeruginosa (PA) в концентрация 6.5 × 105 PA/10 μl или с 10 μl PBS като отрицателен контрол и са заснети през описаните интервали от време. Представителни изображения на затваряне на рани на едно животно в определени часове са показани с идентичен мащаб от 1,5 cm. Фигура 1a комплект от див тип +/+ - мишки, Фигура 1b MZ-дефицитен комплект W/Kit W-v - мишки. - 41 -

* ** ** * * * * * * Фигура 2: Курсът на зарастване на рани при рани, заразени с Pseudomonas aeruginosa, се забавя при мишки с дефицит на MZ Kit W/Kit W-v. Инфектираните Kit +/+ мишки (n = 9), заразените MZ-дефицитни Kit W/Kit Wv мишки (n = 6) и съответните контроли (n = 10 или n = 6) бяха индивидуално третирани с рани в областта на опашната част на гърба Изцелението е документирано. Илюстрацията показва процеса на заздравяване на рани в продължение на 9 дни, нанесена като процентна площ на раната от раните, пробити през ден 0. Данните са обобщени от 2 независими експеримента, с n = 6-10 животни на група и са дадени като средно ± SEM; * = p 1 съответства, например, с триптаза 1 под LPS (2,9 пъти ± 1,3 SEM) и PA (2,2 пъти ± 0,3 SEM), катепсин G под LPS (2,2- пъти ± 1,0 SEM) и PA (1,4 пъти ± 0,1 SEM), MCPT8 под LPS (2,6 пъти ± 0,8 SEM) и PA (1,6 пъти ± 0,2 SEM ), MCPT9 под LPS (3,1 пъти ± 1,5 SEM), както и Granzym B под LPS (2,0 пъти ± 0,6 SEM) и под PA (2,9 пъти ± 1,5 SEM) . За разлика от това, експресията на MCPT9 е регулирана надолу при стимулация с PA (0,7 пъти ± 0,1 SEM). Намаляването на регулацията на определени протеини и протеази се причинява от стойности