Тилман Граулих
Стереол. D. Разследване d. Белите дробове u. Трахея b. д. тумор-кач. Мишка VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN Тел: 0641-5599888 Факс: -5599890 [email protected] www.doktorverlag.de ISBN: 978-3-8359-6616-1 9 7 8 3 8 3 5 Tilman édition scientifique VVB LAUFERSWEILER VERLAG Tilman Graulich Стереологични изследвания на газообменната област на белите дробове и инервацията на трахеята в тумора кахектична мишка Инаугурационна дисертация за придобиване на степен доктор по медицина в медицинския отдел на университета Justus Liebig Giessen 9 6 6 1 6 1 é scientifique VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG
Произведението е защитено с авторски права във всичките му части. Юридическата отговорност за цялото съдържание на тази книга се носи изключително от автора на това произведение. Всяко използване не е разрешено без писменото съгласие на автора или издателя. Това се отнася по-специално за репродукции, преводи, микрофилмиране и съхранение и обработка чрез електронни системи. 1-во издание 2017 г. Всички права запазени. Никоя част от тази публикация не може да се възпроизвежда, съхранява в система за извличане или да се предава под каквато и да е форма или по какъвто и да е начин, електронна, механична, фотокопираща, записваща или по друг начин, без предварителното писмено разрешение на автора или издателите. 1-во издание 2017 2017 от VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Отпечатано в Германия édition linguistique VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Тел.
Стереологични изследвания на газообменната област на белите дробове и инервацията на трахеята в туморната кахектична мишка INAUGURAL DISSERTATION за получаване на степен доктор по медицина в Медицинския факултет на университета Justus Liebig в Гисен, представена от Тилман Граулих от Бохум Хановер 2017
От Института по анатомия и клетъчна биология към Медицинския факултет към Университета Юстус Либиг Гисен Изпълнителен директор: проф. Д-р. Евелин Баумгарт-Фогт 1-ви рецензент: проф. Д-р Mühlfeld 2-ри рецензент: проф. Д-р Ден на диспута на Вайсман: 04.09.2017 г. II
Съдържание Страница 1. Списък на съкращенията VI 2. Списък на фигури VIII 3. Списък на таблици IX I. Въведение 1 I.1. Анатомия на долните дихателни пътища 1 I.1.1. Функция и метаболизъм на повърхностноактивното вещество 4 I.2. Инервация на дихателните пътища 6 I.3. Белите дробове при недохранване и анорексия 7 I.4. Туморна кахексия 9 I.5. Туморна кахексия и долни дихателни пътища 10 I.6. Цел на работата 11 II. Материал и методи 12 II.1. Експеримент с животни 12 II.2. Подготовка и вземане на проби 12 II.2.1. Вземане на проби за микроскопия 12 II.2.2. Бронхоалвеоларен лаваж (BAL) 13 II.3. Подготовка на пробите 13 II.3.1. Вземане на проби за микроскопия 13 II.3.1.1. Подготовка на пробите за светлинна микроскопия 14 II.3.1.2. Подготовка на проби за имунохистохимия 15 II.3.1.3. Подготовка на проби за електронна микроскопия (ЕМ) 17 II.3.1.3.1. Подготовка на пробите за конвенционална трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ) 17 II.3.1.3.2. Подготовка на пробите за имуноелектронна микроскопия (предварително вграждане) 18 II.3.1.3.3. Подготовка на пробите за сканираща електронна микроскопия (SEM) 19 II.3.2. Стереология 19 III
II.3.2.1. Томове 21 II.3.2.2. Повърхности 23 II.3.2.3. Дължини 24 II.3.3. Подготовка на проби за диференциално центрофугиране 26 II.4. Статистика 26 III. Резултати 27 III.1. Телесно тегло и белодробни обеми 27 III.2. Микроскопия 27 III.2.1. Качествена микроскопия 27 III.2.1.1. Светлинна микроскопия 27 III.2.1.2. Имунофлуоресцентна микроскопия 30 III.2.1.3. Трахеален епител при 33 сканираща електронна микроскопия (SEM) III.2.1.4. Качествена трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ) 34 III.2.2. Количествена микроскопия или стереология 35 III.2.2.1. Бели дробове 35 III.2.2.1.1. Обем на газообменния регион/паренхим 35 III. 2.2.1.2. Алвеоларна повърхност 36 III. 2.2.1.3. Алвеоларни епителни клетки тип II 36 III. 2.2.1.4. Връзка на LB с алвеоларния епител 37 III. 2.2.2. Трахея 38 III. 2.2.2.1. Инервация 38 III. 2.2.2.2. Състав на трахеалната стена 39 III.3. Диференциално центрофугиране за определяне на повърхностноактивно вещество 41 IV. Дискусия 42 IV.1. Използвана методология 42 IV.1.1 Настройка на експеримента, вземане на проби, фиксиране 42 IV.1.2. Стереология 46 IV.1.2.1. Вземане на проби 46 IV
IV.1.2.2. Справочни томове 47 IV.1.2.3. Тестови системи в стереологията 48 IV.1.2.4. Ориентация на тъканта 50 IV.1.3. Имунохистохимия 51 IV.2. Дискусия на резултатите 52 IV.2.1. Алвеоларна повърхност 52 IV.2.2. Метаболизъм на повърхностноактивни вещества 58 IV.2.3. Анализ на кръвта 60 IV.2.4. Инервация на трахеята 61 IV.2.5. Морфология на трахеята 63 IV.2.5.1. Хрущял 63 IV.2.5.2. Епител 63 V. Обобщение 65 VI. Резюме 67 VII. Референции 69 VIII. Преглед на материалите 82 VIII.1 Буфери и разтвори 82 IX. CV 85 X. Благодарности 86 XI. Декларация 87 XII. Собствени публикации 88 V
1. Списък на съкращенията:. Фиг Фигура ABCA3 АТР свързваща касета АЕ1 клетки алвеоларни епителни тип клетка I АЕ2 клетки алвеоларни епителни клетъчен тип 2 AK антитяло тип артерия BAL бронхоалвеоларен лаваж BGW съединителната тъкан BMP костен морфогенен протеин брат Bronchius CGRP калцитонин-ген-свързан-Peptides Хондро Chondrozy Лазерна сканираща микроскопия DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium FBS Говежди серум FEV Форсиран обем на издишване FGF Фибробластен фактор на растеж FITC Флуоресцеин Изотиоцианат HRP Хрян Пероксидаза фон Енгл. Horsradishperoxidase KG Контролна група KGF Кератиноцитен фактор на растеж LA LA Големи агрегати LB Ламеларни тела от англ. Ламеларни тела LLC Lewis Белодробен карцином LM Светлинна микроскопия KGF Кератиноцитен фактор на растеж Mito Mitochondria NANC Неадренергични нехолинергични ядра nzz Нецилиентни клетки PBS фосфатен буфер физиологичен разтвор PDGF тромбоцит Производен фактор на растеж VI
PFA PPAR-γ Ref RF SA SD SMC SP SP-A SP-B SP-C SP-D SURS Tab TEM TF TG TGF-β TK TNF-α UA + O UD VEGF ad VIP ZP zz Параформалдехид пероксизомен пролифератор активиран рецептор- γ справка Ричардсън оцветяване Малки агрегати полутънки гладки мускулни клетки от англ. Гладко мускулни клетки Surfactant Protein Surfactant Protein A Surfactant Protein B Surfactant Protein C Surfactant Protein D Systematic Uniform Random Sampling Table Transmission Electron Microscopy Test Fields Tumor Group Transforming Growth Factor β Tumorkachexie Tumor Necrosis Factor-α Uranyl Acettal Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum Ventum
2. Списък на фигурите: Фигура I: Структура на белия дроб по примера на мишката 4 Фигура II: Вземане на проби от белодробни проби за микроскопия 14 Фигура III: Телесно тегло на животните в началото (A) и в края (B) на експериментите 27 Фигура IV: Сравнителна светлинна микроскопия Представяне на белодробния паренхим с алвеоли и капиляри 29 Фигура V: Имунофлуоресцентно микроскопично представяне на инервацията на трахеята 30 Фигура VI: Имунофлуоресцентно микроскопско представяне на трахеята с 3D реконструкция на повърхността 32 Фигура VII: Имунофлуоресцентно микроскопско представяне на нервните влакна на трахеята 33 Фигура VIII върху цяла подготовка на монтиране 33 Фигура VIII Сканиране на изображения с електронен микроскоп на трахеалния епител 34 Фигура IX: Изображения с трансмисионен електронен микроскоп на стената на трахеята 35 Фигура X: Преглед на стереологичните данни за повърхностноактивната система след 21 дни 38 Фигура XI: Дължина на аксона на нервните влакна, съдържащи се в трахеята след 21 дни 39 Фигура XII: Сравнение на стереологичните системи за вземане на проби 47 Фигура XIII: Диаграма на измерените фактори на растежа и техните възможни ефекти 57 VIII
3. Списък на таблици: Таблица I: Използвани антитела (АК) 16 Таблица II: Антитела (АК) за предварително вграждане 19 Таблица III: Брой животни на група на изследвана стереологична стойност 20 Таблица IV: Преглед на определените обемни плътности и обеми 22 Таблица V: Преглед на метода за измерване за определяне на обемната плътност 22f. Таблица VI: Преглед на определените повърхностни плътности и повърхности 24 Таблица VII: Преглед на метода за измерване за определяне на повърхностната плътност 24 Таблица VIII: Обем на белите дробове и газообменната област (паренхим) 36 Таблица IX: Повърхност на алвеолите 36 Таблица X: Стереологични данни на алвеоларните епителни клетки тип II 37 Таблица XI: Стереологични данни за инервацията на трахеята 39 Таблица XII: Стереологични данни за трахеалната стена 40 Таблица XIII: Обекти в космоса, тяхното представяне в разреза и стереологични системи за изпитване 49 Таблица XIV: Количествена PCR на някои растежни фактори в белодробни проби 56 Таблица XV: Анализ на кръвта в TG и KG 61 IX