Теза. Подаден за получаване на диплома по биология във Факултета по биология на Рурския университет в Бохум
Дипломна работа, представена за получаване на диплом по биология в Биологическия факултет на Рурския университет в Бохум Анализ на екстрахируемите и неизвличаеми остатъци от сулфадиазин и неговите метаболити три години след прилагането на свински тор върху лизиметри и ремобилизирането на неизвличаемите остатъци чрез ризосферна активност на царевицата. Изготвено от Wibke Schulte-Hunsbeck по физическа география/почвознание/почвена екология на Факултета по геология в Бохум, през септември. 2009 Лектор: проф. Д-р Бернд Маршнер Съ-рефер: проф. Д-р Доминик Бегеров
Тази дипломна работа е създадена в приятелско сътрудничество с Forschungszentrum Jülich GmbH, член на Асоциацията на германските изследователски центрове Helmholtz. Институт Агросфера ICG 4 Forschungszentrum Jülich GmbH 52425 Jülich (Сграда 16.6) Ръководител на института: проф. Д-р. Хари Верекен за контакт на място: д-р Йоост Грьоневег
Декларация С настоящото заявявам, че съм написал дипломната работа, представена днес самостоятелно, и че не съм използвал други източници и помощни средства освен тези, които са дадени и че съм отбелязал цитати. Настоящата дипломна работа се състои от четири копия, които са напълно идентични като дума и образ. Също така заявявам, че цифровите изображения съдържат само оригиналните данни и че не е извършена обработка на изображения за промяна на съдържанието. Ръководител на дипломната работа беше: проф. Д-р. Бернд Маршнер Като съ-рефери предлагам: проф. Д-р. Доминик Бегероу Бохум, (надпис)
Съдържание Съдържание Списък на фигурите Списък на таблиците Списък на съкращенията и символите 1! Въведение. 13! 1.1! Сулфадиазин. 15! 1.2! Литературен преглед. 16! 1.2.1! Транспорт на вещества в земята. 16! 1.2.2! Сорбция в почвата. 19! 1.2.3! Неизвличащи се остатъци. 24! 1.2.4! Транспортирайте приемането на SDZ в завода. 25! 1.2.5! Разпадане на SDZ в почвата. 26! 1.2.6! Разграждане на SDZ Фотохимично. 27! 1.2.7! Разграждане на SDZ при бозайници. 28! 1.3! Поставяне на цели. 30 2! Материали и методи. 31! 2.1! Описание на тестовите етажи. 31! 2.2! Лизиметър. 33! 2.2.1! Тествайте лизиметър. 35! 2.2.2! История и първоначално състояние на тестовите лизиметри. 36! 2.3! Характеристика на изпитваното вещество. 37! 2.4! Методи. 38! 2.4.1! Вземане на проби от почвата. 38! 2.4.2! Подготовка на почвените проби. 39! 2.5! Придружаващи параметри. 40! 2.5.1! определяне на ph стойност. 40! 2.5.2! Определяне на влагата в почвата. 40! 2.6! Извличане на почвата. 41 ! 6-то!
Съдържание 2.7! Екстракция в твърда фаза. 43! 2.8! Проба на растенията. 45! 2.8.1! Експериментална настройка. 45! 2.8.2! Растения за вземане на проби. 47! 2.9! Аналитични методи. 48! 2.9.1! Окислител. 48! 2.9.2! Измерване на LSC. 50! 2.9.3! LC-MS/MS. 51! 2.10! Оценка. 54 3! Резултати. 56! 3.1! Експерименти с лизиметър. 56! 3.1.1! 0,5 м! -Тестове за лизиметър. 56! 3.1.2! 1 м! -Лизиметър. 68! 3.2! Проба на растенията. 74 4! Дискусия. 83! 4.1! Лизиметър. 83! 4.1.1! Придружаващи параметри. 83! 4.1.2! Балансиране на SDZ в лизиметрите. 85! 4.1.3! Последователна екстракция и анализ на метаболитите. 90! 4.1.4! Сорбция на SDZ. 94! 4.2! Проба на растенията. 97! 4.2.1! Придружаващи параметри. 97! 4.2.2! Ремобилизация на изолиран SDZ чрез ризосферна активност. 98! 4.3! Обобщение. 100 5! Библиография. 101! 6! Приложение А. 106 ! 7-ми!
Съдържание Табл. 20: Еквивалентна концентрация (c eq) на SDZ [mmol g -1] на последователното извличане от почвени проби от теста за лизиметър и теста за засаждане A2 (Kal) и B2 (Mer). 81! Таблица 21: Концентрация на SDZ и неговите метаболити [mmol g -1] на ацетото. + H 2 O екстракция в почвени проби от експеримента с лизиметър и експеримента за засаждане A2 (Kal) и B2 (Mer) 82! Таблица 22: Еквивалентно количество (A екв.) SDZ [mmol] от последователното извличане от почвените проби чрез лизиметър А1 (Kal) до дълбочина 30 cm в деня на вземане на проби 29, 120, 218, 1022. 106! Таблица 23: Еквивалентно количество (A екв.) SDZ [mmol] от последователното извличане от почвените проби с лизиметър B1 (Mer) до дълбочина 30 cm в деня на вземане на проби 29, 120, 218, 1022. 107 ! 11.!
Съдържание Списък на съкращенията и символите Съкращение 4-OH-SDZ 4-Hydroxysulfadiazine APG активност на грам почва [Bq g -1] Еквивалентно еквивалентно количество [mmol] Aceto. Acety-SDZ BBA c eq Ацетонитрил N-ацетил-сулфадиазин Насоки за изпитване на продукти за растителна защита и еквивалентна концентрация на растителнозащитно оборудване [mmol g-1] ДНК дезоксирибонуклеинова киселина FZJ Forschungszentrum Jülich GLP Добра лабораторна практика HPLC Интегрирана технология на течността Калгенс Халмек Калченс Халмек Калченс Халмек Калченс Халмек Калцхенхрик Калчен Хидрохлорид Халцехлохмал Калцхенхрик Халмохрома K/B съдове Kick/Brauckmann k OC LC-MS/MS LSC Mer MRSA MS NER PKs Коефициент на сорбция (n = подходящ за органичен въглерод) течна хроматография, свързана към тандемна масспектрометрия Течен сцинтилационен брояч Merzenhausen щамове Staphylococcus aureus щамове Мас спектрометър Неекстрахируеми остатъци отрицателен десетичен логаритъм на киселинната константа K s! Плътност [g cm - "] SDZ Sulfadiazine SOP Стандартни инструкции за експлоатация SPE Екстракция в твърда фаза СЗО Световната здравна организация Wk макс. Максимален капацитет за задържане на вода [%]! 12!
Въведение SDZ Транспорт в почвата Транспортните проучвания със SDZ показват, че различни резултати водят до SDZ да се прилага с вода или с течен тор. Ако SDZ се прилага заедно с течен оборски тор, изследванията на Burkhardt et al. (2005), Kay et al. (2005) и Blackwell et al. (2007), че суспензията благоприятства повърхностния отток на SDZ. Изследванията показаха, че течният тор поради своето твърдо съдържание затваря фините почвени пори и по този начин SDZ се оттича по-бързо от другите антибиотици (Burkhardt et al., 2005). Тук видът на почвата е без значение; бърз повърхностен отток се наблюдава както в глинести почви (Blackwell et al., 2007), така и в песъчливи почви (Kay et al., 2005). Когато SDZ се внася с течен тор, SDZ навлиза в почвата чрез преференциалния поток, както е показано от проучвания на Burkhardt (2007). 18-ти!
По-скоро инициирайте концентрацията му. Колкото по-висок е делът на йон в почвения разтвор, толкова по-висок е делът му в йонното покритие (Schroeder and Blum, 1992). Вътрешно-сферичният комплекс на SDZ се основава на образуването на сложни съединения и осигурява специфичната сорбция. Молекулата или йонът на почвения разтвор действа като лиганд и измества лиганд, координиран около централния атом на металния йон. Поради образуването на ковалентни връзки между лигандите, тези вътрешно-сферични комплекси са силно стабилни (Scheffer и Schachtschabel, 2002). Фиг. 3: Сорбция на катиони върху оксидна или глинеста минерална повърхност с променлив заряд (Sigg & Stumm 1994 Aquati Chemistry, Teubner, Щутгарт). 21-ви!
Въвеждането на въглероден диоксид трябва да бъде изключено. Само дял от 2% от общото дадено количество е оценен като 14 CO 2. Това показва, че SDZ може да се разгражда само много бавно в почвата. В настоящите разследвания могат да се направят изявления за продуктите от разграждането, при което 4-OH-SDZ, формил-SDZ и 4- (2-минопиримидинил-1 (2Н)) анилин са идентифицирани (inter alia: Sukul et al., 2008). 1.2.6 Фотохимично разграждане на SDZ Разграждането на SDZ от слънчева светлина (UV лъчение) е чисто абиотичен механизъм на разграждане. Фотолитичното разграждане е наред с други от Sukul et al. (2008) и Wollters and Steffens (2005). Ако SDZ се нанася с каша, той се излага на UV лъчение за по-дълго. Този път на разлагане за SDZ е възможен само в ограничена степен в почви. Фотохимичното разграждане зависи силно от стойността на ph и по този начин от околните компоненти. В случай на фотохимична деградация, доминира непряката фотолиза (Wolters and Steffens, 2005). Компонентите, възбудени от светлинни кванти, могат да предадат тази стимулация на SDZ и по този начин да я стимулират да се разпадне. Фоточувствителните вещества могат да причинят увеличаване на фоторазграждането, например водороден прекис, хуминови киселини, фулвокиселини и ацетон (Sukul et al. 2008).! 27!
Въведение 1.2.7 Разграждане на SDZ при бозайници По време на биотрансформацията на SDZ при прасета, 96% от приложените SD-маркирани SDZ се екскретират. Това означава, че само 4% се поглъщат от животното. Биотрансформацията на SDZ при свинете е описана от Lamshöft et al. (2007) разгледани подробно. Радиоактивно белязан SDZ (14 C-SDZ) се хранеше на свине в продължение на четири дни и техните екскреции (тор) се събираха ежедневно в продължение на 10 дни след приложението. Събраните проби от суспензия се анализират за SDZ и неговите метаболити. 44% от SDZ се екскретира заедно с основните метаболити. Основните открити метаболити са ацетил-SDZ (21%) и 4-OH-SDZ (26%). Други вторични метаболити са N-формил-сулфадиазин (0,1%) и N-ацетил-4-сулфадиазин (1,8%). Максималната екскреция е настъпила на шестия ден след приложението. При разпределението на активността в оборския тор 80% са открити в твърдото вещество и 20% в течната фаза. Фигура 7 показва продуктите от разграждането на SDZ при свинете. Фиг. 7: Разграждане на 14 C-SDZ чрез биотрансформация, (* = местоположение на маркировката 14 C) (Lamshöft et al., 2007).! 28!
Въведение Разграждането обикновено се извършва при бозайници в две фази. В първата фаза ензими като Монооксигеназата и редуктазата се разделят на функционалните групи или, както при хидролазата, са прикрепени функционални групи (-ОН). Във втората фаза полученият метаболит се свързва с ендогенно, водоразтворимо вещество. Това увеличава водоразтворимостта на веществото, което трябва да се разгради и то може да бъде отделено по-лесно. SDZ се елиминира главно чрез бъбреците и само в малка степен чрез черния дроб и червата (Sukul и Spiteller; 2006). SDZ се превръща напълно в SDZ форма в оборски тор от метаболити (Langhammer, 1989). Таблица 3: Характеризиране на двата основни метаболита 4-OH-SDZ и ацетил-SDZ 4-хидроксисулфадиазин N-ацетил-сулфадиазин (4-OH-SDZ) (ацетил-SDZ) сума форма C 10 H 11 N 4 O 3 SC 12 H 14 N 4 O 4 S моларно тегло 267,27g/mol 310,32g/mol! 29!
Материал и методи Kaldenkirchen (Kal) Braunerde N: 51 18 25 O: 6 12 12 Merzenhausen (Mer) Parabraunerde N: 50 55 50 O: 6 17 47 Фиг. 8: Преглед на местоположенията на полетата: Merzenhausen (Mer) и Kaldenkirchen (Kal) в NRW.! 32!
Материал и методи Фиг. 9: Схематичен чертеж на системата за външен лизиметър на ICG-4 с вдлъбнато, ъглово 1 m! Подов монолит (Pütz, 1993).! 34!
Материал и методи 2.3 Характеризиране на изпитваното вещество Течният тор, използван за този експеримент от експериментите за хранене, както е описано от Lamshöft et al. (2007) Раздел 1.2.7. Използваният 14 C-SDZ с чистота 99% има специфична активност от 8,6 MBq mg -1 и се произвежда от Bayer AG, Wuppertal. SDZ е радиоактивно белязан върху 2C атома на анилиновия пръстен (14 C-SDZ), виж Фигура 11. SDZ с маркиран 14 C е смесен с немаркиран SDZ в съотношение 1:20 (w/w). Немаркираният SDZ е доставен от Fluka, Seelze. Радиоактивно белязан SDZ (14 C-SDZ) се дава на две прасета. Успоредно с това, немаркиран SDZ се прилага перорално на две други прасета в рамките на 4 дни. Животните, които са получили 14 C-SDZ, са получили обща доза от 540 mg d -1 (928,8 MBq). Това съответства на 30 mg kg -1 d -1 телесно тегло. Животните, които са получили немаркиран SDZ, са получили обща доза от 570 mg kg -1 d -1 телесно тегло. Пробите от течен тор, събрани ежедневно за период от 10 дни, бяха анализирани с използване на детектиране на 14 ° С. Фиг. 11: 14 С-маркиран сулфадиазин (14 C-SDZ) (* = местоположението на 14-С маркировката) (Lamshöft et al. 2007) 37
Материал и методи 2.4.2 Подготовка на почвените проби За следващите анализи почвата се пресява на 2 mm и се прехвърля в PE торби. След това стойността на рН и влажността на почвата бяха определени в почвата, влажна в полето. За допълнителни анализи почвата се изсушава при 105 ° С до постоянно тегло. След това приблизително 200 g се хомогенизират с планетарна мелница (Retsch PM4) (15 минути при 250 rpm; Förster et al., 2009). В случая на планетарната мелница центробежната сила притиска земния материал (проба от почвата) със смилащите топчета (пет парчета) към стената на мелещата купа и го смачква чрез триене. Схематично представяне на работните стъпки може да се види на Фигура 12. Полево-прясна почва на 2 mm седем съпътстващи параметъра (ph-стойност, влажност на почвата) -сушене -хомогенизиране-екстракция на почвата -Окислител -LSC анализ -LC-MS/MS Фиг. 12: Диаграма на работните стъпки на обработката на почвената проба.! 39!
Материал и методи 2.5 Придружаващи параметри 2.5.1 Определяне на стойността на рН Стойността на рН се определя въз основа на DIN ISO 10390. Стойността на рН се определя в суспензия от разтвор на почвата и калциев хлорид (0,01 М) след едночасово време на излагане с периодично смесване с рН-метър. PH-метърът се калибрира със стандартните буферни разтвори ph 4 и ph 7 преди употреба (Blume et al. 2000). Условия за анализ Бяха извършени три повторения на почвен слой. ph-метър: Mettler Toledo 1120X Тегло: 10 g въздушно-суха почва Реагент: 25 ml 0,01 M разтвор на калциев хлорид 2.5.2 Определяне на влажността на почвата Влагата на почвата е един от най-простите параметри за описване на водното състояние на почвата. т.е. гравиметрично, чрез отклонението на теглото. Влажната почва, прясна от полето, се претегля и изсушава до постоянно тегло. Определянето на влагата в почвата се извършва съгласно DIN ISO 11465 (1996-12). Влагата в почвата се дава по отношение на мократа маса на почвата в% от масата. Условия за анализ Бяха извършени три повторения на почвен слой. Суха скала: Mettler Toledo HB43-S Халогенно тегло: 0,3 g-2 g почва! 40!
Материал и методи Раздел 6: Схематична последователност на последователно извличане съгласно Förster et al. (2009). Претегляне в: 10 g почва в центрофужни епруветки CaCl 2 екстракция Me-OH екстракция Aceto.-H 2 O екстракция -Реагент: 25 ml, 0,01 M разтвор на CaCl 2 -24 часа разклащане над главата -центрифугиране * -декантация-претегляне на Измерете супернатантата -1 ml в LSC (сцинтилатор: 10 ml Ultima Gold) -реагент: 25 ml, метанол -4 h разклащане над главата -центрифугиране * -декантиране-претеглете супернатантата -2 ml в LSC (сцинтилатор: 10 ml Instagel) -Микровълново разграждане -Реагент: 50 ml 1: 4 (v: v) ацетонитрил: вода! Вземете 20 ml от почвата-разтворител суспензия -центрифугиране ** -декантиране-претеглете супернатантната мярка -1 ml в LSC (сцинтилатор: 10 ml Instagel)! Останал екстракт - центрофугиране * - преливане - претегляне на супернатантата - изхвърляне на супернатанта Изсушете дъното в стъклото на центрофугата за по-късно изгаряне в окислителя *: Allegra 6KR, 30 минути при 900 * g **: J2-21 HS, 30 минути при 40 000 * g! 42!
Материал и методи Раздел 7: Работни стъпки за пречистване на CaCl 2 екстрактите с помощта на SPE. Стъпка Обем реагент 1 3 ml метанол 2 3 ml 5:95 метанол: дестилирана вода 3 3 ml дестилирана вода Вода 4 X * CaCl 2 екстракт 5 20 ml разст. Вода 6 Изсушете патрона 15 минути 7 3 ml метанол, подкиселен до рН2 *: Екстрактът от CaCl2 се обединява преди да се приложи върху колоната, 1 ml се отстранява и се измерва в LSC. Остатъкът се претегля и центрофугира (30 минути при 40 000 * g; J2-21HS). Супернатантът се нанася върху колоната. Условия за анализ SPE колона: Oasis HLB 6 cc-200 mg (Waters Oasis) Вакуум помпа: Vacumbrand SPE приставка: SPE-24G Киселина за подкисляване: 200 µl мравчена киселина! 44!
Материал и методи Фиг. 13: Експериментална подготовка на експеримента със засаждане, (изглед: царевични растения в съдове Kick/Brauckmann под пейката за отглеждане на растения) Материали Kick/Brauckmann съдове: 16 броя (Ø = 22 см) Пълен тор: около 3 g синьо зърно (ENTEC, COMPO) Ядки от царевица: 12 бр. PR39K13 (Early Star, Baiano) Везна: Mettler Toledo G5002-2 Суха люспа: Mettler Toledo HB43-S Халоген Други: алуминиево фолио, мерителна чашка, ръчна лопата, сгъваемо правило! 46!
Материал и методи 2.8.2 Растения за вземане на проби Експериментът приключва след около 80 дни. Записано е общото тегло на тестовата уредба, теглото на съдовете Kick/Brauckmann, надземните (стъбла и листа) и подземните части на растението и теглото на почвата. Ризосферата беше изложена грубо само чрез смачкване на трохите с пръсти. Почвата се отделя от останалите малки и фини корени чрез пресяване (