Техники за хистологично оцветяване като инструменти за анализ на храните Възможности и граници
1 семинар по хистология на храните/56-ти семинар по хигиена на храните GAP Хистологични техники за оцветяване като инструменти при инспекция на храните Възможности и ограничения Лице за контакт: Александра Бартолома Съвет и оценка Тел.: +49 (2151) Факс: +49 (2151) Служба за химически и ветеринарни изследвания Rhein-Ruhr-Wupper AöR, Страница 1 Deutscher Ring 100, интернет в Крефелд:
2 Рутинни методи за хистологично изследване на храни Официална колекция от методи за изследване (ASU) съгласно 35 LMBG L (декември 1989 г.) Определяне на тъканния състав на месото, месните продукти и колбасните продукти Рутинни методи за качествено и количествено хистологично изследване Срок: Под тъканно-съществения състав на месните продукти разбирал сумата от обработените части на заклани или убити топлокръвни животни. Идентифицираните клетки от растителен произход могат също да бъдат включени в констатациите относно съществената природа. Страница 2
3 метода за оцветяване съгласно ASU L стр. 3
4 Допълнителни методи за оцветяване стр. 4
5 Оцветяване на Calleja Принцип: с пикроиндиго кармин като плазмено оцветяване, различни тъканни компоненти се оцветяват по различен начин; оцветяването на ядрото се извършва с ядрено бързо червено Оценка: Клетъчни ядра: червеникаво-кафеникави (интензивно ядрено оцветяване трудно достижимо) Мускули нагрявани: светло зелено, ненагрято: силно зелено до тъмно зелено голям паренхим, други тъкани: (светло) зелена колагенова съединителна тъкан нагрята: бледосиня, ненагрята: синя еластична съединителна тъкан: жълт хрущял, кости: синя страница 5
6 Оцветяване Calleja-Lugol = комбинация от оцветяване Calleja и оцветяване на Lugol Употреба в продукти, съдържащи въглехидрати (напр. Кюфтета) Употреба в проби, които имат макроскопски положителен за Lugol принцип: освен това, въглехидратите (особено естественото нишесте) се откриват в Lugol Йодът, съдържащ се в разтвора, се отлага в спираловидните спирали на въглехидратите и ги показва в синьо и черно, за да се направи разлика между нишестето и подобно структурираните въглехидрати с -1,4-свързване от други въглехидрати, а при паралелни разфасовки може да се извърши третиране с амилаза преди боядисване (0, 5% разтвор на амилаза във фосфатен буфер в продължение на 2 часа) (в миналото: проба от слюнка) обработката с амилаза служи за проверка на якостта на паралелните участъци, третирани с амилаза, съдържащи нишесте, структурите, предварително покрити от синьо-черната дебелина, могат да бъдат оценени стр. 6
7 Оцветяване на Calleja (Lugol) Оценка: органите и тъканите са показани както при оцветяването на Calleja, освен това въглехидратите с - спирали са оцветени в кафяво до черно Резултат след третиране с амилаза: Нишесте и подобно структурирани въглехидрати със съединение -1,4 не се откриват или не са показани на страница 7
8 Опции за оцветяване Calleja (Lugol): преглед и диференциално оцветяване! количествена оценка чрез допълнително изследване за много тъкани/органи (не черен дроб!) възможна идентификация и (полу) количествено определяне на количеството на: скелетни, сърдечни и езикови мускули (включително степен на раздробяване) съединителна тъкан (колагенна/еластична съединителна тъкан) костна тъкан, хрущялна тъкан, съдове, Жлезиста тъкан, лимфна тъкан, нервна тъкан, кожна лигавица черен дроб, бъбреци, бели дробове и други карантии преработено колбасно месо със и без обвивка (възможни са фалшиви отрицателни резултати) растителни компоненти (напр. Подправки, трюфели) защита на клетъчни растителни клетки чрез поляризиращ микроскоп) страница 8
9 Оцветяване с Calleja (Lugol) Възможности: Индикация за наличие на немесни добавки Диференциация на сурови и нагрети материали Откриване на нишесте и аналогични въглехидрати с -1,4- връзка (само оцветяване Calleja-Lugol) Индикация за наличие на въглехидрати в оцветяването на Calleja-Lugol, ако структурите останат оцветени след третиране с амилаза стр. 9
10 Ограничения на Calleja (Lugol): в зависимост от степента на нагряване, клетъчните ядра понякога не се показват оптимално. Във въглехидратите не се откроява в оцветяването Calleja. С оцветяването Calleja-Lugol откриването на KH е свързано с определена структура на молекулата KH Страница 10
11 Calleja (Lugol) оцветяващ колбас с език 25x страница 11
12 Calleja (Lugol) оцветяващ колбас с език 100x страница 12
13 Calleja (Lugol) оцветяване на варени колбаси 25x страница 13
14 Calleja (Lugol) оцветяване варен колбас 100x страница 14
15 Calleja (Lugol) оцветяване на варен колбас 25x страница 15
16 Calleja (Lugol) оцветяване на варен колбас 100x страница 16
17 Calleja (Lugol) оцветяване на суров колбас 25x стр. 17
18 Calleja (Lugol) оцветяване суров колбас 100x страница 18
19 Calleja (Lugol) оцветяване варен салам 100x страница 19
20 Calleja (Lugol) оцветяване варен салам 100x страница 20
21 Calleja (Lugol) оцветяване на червен колбас 25x стр. 21
22 Calleja (Lugol) оцветяване на варен колбас 100x страница 22
23 Calleja (Lugol) оцветяване на варен колбас 100x страница 23
24 Calleja (Lugol) оцветяване колбаси от птиче месо 100x страница 24
25 Calleja (Lugol) оцветяване на чернодробна наденица 25x страница 25
26 Calleja (Lugol) оцветяване на варен колбас 25x страница 26
27 Calleja (Lugol) оцветяване на варен колбас 100x страница 27
28 Calleja (Lugol) оцветяване на варен колбас (Wiener) 100x страница 28
29 Calleja (Lugol) оцветяване на варен колбас (Wiener) 100x страница 29
30 Оцветяване с хематоксилин-еозин (HE) Преглед на оцветяването, често наричано оцветяване с хемал-еозин Принцип: Органните структури могат да бъдат диференцирани чрез оцветяване на клетъчните ядра с хематоксилин и цитоплазмата с еозин Оценка: Клетъчни ядра: синьо-виолетова цитоплазма: розова страница 30
31 Оцветяване с хематоксилин-еозин (HE) Възможности: Подозрителни констатации, направени с оцветяването Calleja (напр. Доказателства за сърцето, черния дроб, бъбреците, белите дробове, кожната лигавица, кожата на птиците, кората) могат да бъдат проверени, тъй като клетъчните ядра и цитоплазмата контрастират. Граници: в сравнение За оцветяването на Calleja, съединителната тъкан и мускулите са по-трудни за диференциране и количествено определяне поради липсата на цветни контрасти. Въглехидратите не са подчертани. Рутинната употреба успоредно с оцветяването на Calleja не е необходима.
32 Хематоксилин-еозин (HE) оцветяване на чернодробна наденица 100 пъти стр. 32
33 Импрегниране със сребърен нитрат според диференциалното оцветяване на Kossa за откриване на костна тъкан Принцип: свързаният калций в карбонатите и фосфатите се обменя за сребърни йони чрез добавяне на пирогалол и калиев перманганат, сребърното съединение се редуцира до метално сребро, значителни концентрации на калций се свързват само в костите, други Разтворимите калциеви йони се измиват по време на предварителната обработка на секциите Оценка: Костни частици: черно Цитоплазма: червено-кафяви Клетъчни ядра: червена страница 33
34 Импрегнация от сребърен нитрат според варената наденица Kossa 100x стр. 34
35 Трихромно оцветяване по Pfeiffer, Wellhäuser и Gehra - Alizarin S-оцветяване Диференциално оцветяване за качествено и количествено откриване на минерализирани костни частици Принцип: Минерализирана кост означава съдържащ калций костен материал (хидроксиапатит) с рН 4,3-4,5 калцият на костите (както и други двувалентни катиони (Mg, Al)) и ализарин S защита от ярко жълто-червено хелатно съединение (оцветен лак) (не е описано в ASU): допълнително оцветяване на участък, предварително декалциран с 5% азотна киселина от същия материал В декалцифицираната секция, с запазена морфология, костните частици придобиват синия цвят на останалата част от тъканта, тъй като калцият е бил разтворен. Преброяване на костни частици (не е описано в ASU): 10 секции или приблизително 40 cm² се изследват за количествено броене (Bijker et al., 1984 ) Страница 35
36 Оцветяване с трихром според Pfeiffer, Wellhäuser и Gehra - Оцветяване с Alizarin S Оценка: Кости: червен хрущял: син Мускули и съединителна тъкан: син Резултат след лечение с азотна киселина: Мускули, съединителна тъкан, деминерализирани кости: синя пещера: Отстраняване на костните частици по време на приготвянето на препаратите, напр. Много големи костни частици могат да бъдат изтласкани от среза при рязане, при прорязването остава видима празнина Деминерализация на костните частици (напр. Чрез по-дълго съхранение на формалин) Костното съдържание не може да бъде надценено, а по-скоро подценено стр. 36
37 Трихромово оцветяване по Pfeiffer, Wellhäuser и Gehra - Alizarin S оцветяване колбаси от птиче месо 25x стр. 37
38 Трихромово оцветяване по Pfeiffer, Wellhäuser и Gehra - Alizarin S оцветяване на колбаси от домашни птици 100x страница 38
39 Трихромово оцветяване по диференциално оцветяване на Charvat за откриване на преработена попарена наденица Принцип: оцветяването открива частици дим (в обвивката и месото от колбаси отдолу). Цветът показва повърхността на наденица, променена след пушене и тъканта, директно прикрепена към нея. Оценка: Ръбове на пушени части от колбаси: оранжево-червено Останали части от препарата: сиво-зелените частици от преработена наденица обикновено са по-уплътнени поради двукратното нагряване и не са напълно интегрирани в месото от колбаси, колкото повече се претрошава преработеният материал, толкова по-трудно е да се открие страница 39
40 Оцветяване на трихрома според възможностите на Charvat: В зависимост от интензивността на пушенето е показан оранжево-червен слой с ширина μm. Доказателствата за пушене могат да бъдат извършени и след отстраняване на обвивката (обелено черво) Ограничения: непушено естествено черво (варени колбаси, колбаси от къри) не може да бъде показано Поради по-голямата си дебелина и съществуващите включвания в оцветяването на Grocott (черно) или в пропускащата поляризация на светлината (спектрални цветове), преработените частици варени колбаси могат да бъдат разпознати и в цвета Calleja или Calleja-Lugol поради уплътнената структура и по-интензивния зелен цвят! Страница 40
41 Трихромово оцветяване според варен колбас Charvat 100x стр. 41
42 Трихромово оцветяване според варени колбаси Charvat 200x стр. 42
43 Calleja Lugol оцветяване на варен колбас 25x стр. 43
44 Оцветяване по Grokott Диференциално оцветяване Импрегнирането със сребро се използва за откриване на въглехидрати с 1,2 диолови групи, напр. В сгъстителите, растителните протеинови препарати и естествените черва, растителните протеинови препарати съдържат остатъци от компоненти на клетъчната стена (въглехидрати), които се виждат като включвания в протеиновите частици поради оцветяването на Grokott (1,2-диолови групи) те идват напр. в нишестето, брашното от гуар, брашното от рожков, агарът, алгинатът, ксантанът и целулозните производни пред хидроксилните групи се окисляват до алдехиди с хромова киселина, тези алдехидни групи намаляват сребърния нитрат и са показани кафяво-черни и след това тонизирани със златен хлорид страница 44
45 Специални петна: Оцветяване с Grokott Оценка: Въглехидрати (KH): черно Мускули: розово Съединителна тъкан: розово Растителен протеин: розов, когато има доказателства за растителни, т.е. Съдържащи въглехидрати протеинови частици, черно оцветените въглехидрати се съхраняват в розово оцветените протеинови частици, колкото по-високо пречистени са растителните протеини, толкова по-малко въглехидрати присъстват и могат да бъдат открити Паралелни разфасовки се извършва обработка с амилаза преди боядисване Резултат след обработка с амилаза Нишесте и подобно структурирани въглехидрати с α-1,4-връзка не се откриват стр. 45
46 Оцветяване с Grokott Възможности: Откриване на богати на протеини, зеленчукови брашна и протеинови препарати Растителни протеинови препарати: соя, памучно семе, лупина, рапица, слънчоглед, пшеница, царевица, леща, боб Морфологични критерии: Брашна: Палисадни и часовникови стъклени клетки от соево брашно Протеинови препарати: напр. TVP - гъбеста структура на пшеничен глутен, тип къдрав соев протеин Ограничения: хидролизатите, които не се откриват, видът растителен протеин не може да бъде определен, морфологията дава улики за произхода страница 46
47 Варен колбас Grokott (Wiener) 200x страница 47
48 Бауер-Калеха-Ф./Кораб с периодична киселина s Reganz-F. (PAS) Диференциално оцветяване Двете петна служат за откриване на въглехидрати с 1,2 диолови групи в растителните протеинови препарати на TVP съдържат остатъци от компоненти на клетъчната стена (въглехидрати), които се виждат като включвания в протеиновите частици. Оцветяването на Бауер-Калея се извършва съгласно ASU с окисление от хромова киселина: багрилото се свързва с 2 съседни свободни алдехидни групи, алтернативно по-малко агресивната периодична киселина може да се използва за окисляване (= PAS цвят) Принцип: откриват се полизахариди, при които има две хидроксилни групи върху непосредствено съседни въглеродни атоми (1,2 диолни групи) ела напр. в нишесте, брашно от гуар, брашно от рожков, агар, алгинат, ксантан и целулозни производни пред хидроксилните групи се окисляват до алдехиди с хромова киселина (петно от Бауер-Калея) или периодична киселина (PAS) страница 48
49 Бауер-Калеха-Ф./Кораб с периодична киселина Reganz-F. (PAS) Оценка: Въглехидрати: червено-виолетови мускули: зелена еластична съединителна тъкан: жълт колаген. Съединителна тъкан, хрущял, кости: бледосин растителен протеин: обработка със зелена амилаза за диференциране на нишесте и подобно структурирани въглехидрати с - 1,4-връзка от други въглехидрати, амилазна обработка може да се извърши на паралелни участъци преди боядисване. Резултат след обработка с амилаза нишесте и аналогично структурирани въглехидрати с α -1,4-връзката са неоткриваеми Възможности и ограничения: както при оцветяването на Grokott страница 49
50 Readzic Acid Ship s Reganz-F. (PAS) варен колбас (полски виенски) 200x страница 50
51 Заключения Определянето на тъканния състав на месните продукти и колбасните изделия отново придобива значение през последните години, не може да бъде заменено от съвременни аналитични методи, тъй като методът на директно откриване по много въпроси е необходим за определяне на важни за качеството, намаляващи качеството и забранени и декларируеми компоненти дава възможност за диференциация, идентификация и количествено определяне на използваните съставки и предоставя информация за производствената технология.Отклоненията от общото възприятие на широката общественост могат да бъдат резултат от използването на необичайни тъкани, повишена степен на раздробяване или количество освободен мускулен протеин или добавяне на преработено месо страница 51
52 Заключения Добавянето на немесни съставки като растителни протеинови препарати, сгъстители, високомолекулни хидролизати на съединителната тъкан или растителни влакна, които изискват деклариране или не са разрешени в зависимост от продукта, се откриват с помощта на специални оцветители. Достатъчна продаваемост! Страница 52
53 Благодаря за вниманието! Лице за контакт: Александра Бартолома Съвети и оценка Тел .: +49 (2151) Факс: +49 (2151) Служба за химически и ветеринарни разследвания Rhein-Ruhr-Wupper AöR, страница 53 Deutscher Ring 100, Krefeld Интернет: