ТЕХНИЧЕСКИ УНИВЕРСИТЕТ В Мюнхен - PDF безплатно изтегляне
TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Клиника и поликлиника за травматологична хирургия на Klinikum rechts der Isar The MDR 2 нокаутираща мишка като модел на чернодробната остеодистрофия Andrea Schmid Пълно копие на дисертацията, одобрена от Медицинския факултет на Техническия университет в Мюнхен за придобиване на академичната степен на доктор по медицина Председател: Унив.-проф. Д-р E. J. Rummeny Проверяващ на дисертацията: 1. ап. Проф. Д-р А. К. Нюслер, Университет Еберхард-Карлс в Тюбинген 2. Унив.-проф. Д-р Р. фон Айзенхарт-Роте Дисертацията е подадена в Техническия университет в Мюнхен на 31 юли 2012 г. и приета от Медицинския факултет на 13 ноември 2013 г.
Съдържание Съдържание Списък на съкращенията 1 Въведение 1 1.1 Общо въведение 1 1.2 Черен дроб 1 1.2.1 Хистологична структура на черния дроб 1 1.2.2 Физиологични функции на черния дроб 2 1.2.3 Патофизиология на черния дроб 3 1.3 Кости 4 1.3.1 Костна структура, костна структура и клетки 4 1.3.2 Ремоделиране и физиологични задачи на костта 5 1.3.3 Дисбаланс на костния метаболизъм 6 1.4 Ситуация на изследване 7 1.4.1 Костни промени при хронични чернодробни заболявания 7 1.4.2 Обратимост на чернодробната остеодистрофия 8 1.5 Витамин D метаболизъм 10 1.6 Ролята на TGF-β в черния дроб и костен метаболизъм 11 1.7 Алтернативен животински модел 13 1.8 Изследователски въпрос 14 2 Материал и методи 15 2.1 Дизайн на изследването 15 2.2 Тествани животни 16 2.2.1 Щамове на мишки 16 2.2.2 Подготовка на препарата 17
Съдържание 2.2.2.1 Материал 17 2.2.2.2 Метод 17 2.3 Хистология 18 2.3.1 Хистотехнология 18 2.3.1.1 Фиксиране на проби от чернодробна тъкан 18 2.3.1.1.1 Материал 18 2.3.1.1.2 Принцип 18 2.3.1.1.3 Извършване на фиксиране на тъкани 18 2.3 .1.2 Дехидратация и вграждане на проби от чернодробна тъкан 18 2.3.1.2.1 Материал и оборудване 18 2.3.1.2.2 Принцип на дехидратация и вграждане 19 2.3.1.2.3 Провеждане на дехидратация и вграждане 19 2.3.1.3 Производство на парафинови секции 19 2.3. 1.3.1 Материал и оборудване 19 2.3.1.3.2 Принцип на подготовка на раздели 20 2.3.1.3.3 Процедура 20 2.3.1.4 Оцветяване и монтиране на хематоксилин-еозин 20 2.3.1.4.1 Материал 20 2.3.1.4.2 Принцип на хематоксилин Оцветяване с еозин 21 2.3.1.4.3 Извършване на оцветяването 21 2.3.1.5 Оцветяване и монтиране на трихром Masson-Goldner 23 2.3.1.5.1 Материал и оборудване 23 2.3.1.5.2 Принцип на оцветяване с трихром Masson-Goldner 24 2.3. 1.5.3 Извършване на оцветяването 24 2.3.2 Светлинна микроскопска оценка на чернодробни секции Подготовка 27 2.3.2.1 Устройства и софтуер 27 2.3.2.2 Принцип на светлинно микроскопско оценяване 27
Съдържание 2.3.2.3 Извършване на светлинна микроскопска оценка 27 2.4 Определяне и оценка на стойностите на кръвния серум 28 2.4.1 Определяне на ензимната активност 28 2.4.1.1 Материал, оборудване и софтуер 28 2.4.1.2 Принцип на определяне на ензимната активност 29 2.4.1.3 Извършване на определяне на ензимната активност 29 2.4.2 TGF-β -Определяне на концентрация 31 2.4.2.1 Материали, устройства и софтуер 31 2.4.2.2 Принцип 32 2.4.2.3 Изпълнение на определяне на концентрацията на TGF-β 32 2.5 Измервания на микро-СТ 35 2.5.1 Устройство и софтуер 35 2.5.2 Принцип на измерване на µct 35 2.5 .3 Извършване на измерването на µct 35 2.5.4 Описани костни параметри 36 2.6 Количествено определяне на генната експресия в черния дроб и костната тъкан 36 2.6.1 Изолация на РНК от черния дроб и костната тъкан 36 2.6.1.1 Материал, оборудване и софтуер 36 2.6.1.2 Принцип на РНК Изолация 37 2.6.1.3 Извършване на РНК изолацията 38 2.6.2 Комплементарен синтез на ДНК (cdna) 40 2.6.2.1 Материал и оборудване 40 2.6.2.2 Принцип на синтеза на cdna 40 2.6.2.3 Изпълнение g cdna синтез 41 2.6.3 амплификация на cdna с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR) и електрофоретично разделяне на ДНК 41 2.6.3.1 материал, оборудване и софтуер 41
Съдържание 2.6.3.2 Принцип на PCR и гел електрофореза 42 2.6.3.3 Провеждане на PCR и гел електрофореза 43 2.6.3.4 Приложени праймери 44 2.6.4 Денситометрична оценка на генната експресия 46 2.6.4.1 Софтуер 46 2.6.4.2 Принцип и изпълнение на денситометричната оценка 46 2.7 Статистическа Оценка 46 2.7.1 Софтуер 46 2.7.2 Извършване на статистическата оценка 46 3 Резултати 47 3.1 Хистологична оценка на чернодробната тъкан с течение на времето 47 3.2 Повишени нива на трансаминаза и дехидрогеназа в кръвния серум на MDR2 -/- мишки 51 3.2.1 Ензимна активност LDH 51 3.2. 2 Ензимна активност ASAT 52 3.2.3 Ензимна активност ALAT 53 3.3 Променена костна архитектура при MDR2 -/- мишки 54 3.3.1 Артериална структура на кората на кората 54 3.3.2 Архитектура на костна кост 56 3.4 Хронично повишени серумни нива на TGF-β в MDR2 -/- мишки 60 3.5 Намалена експресия на костни маркери в по-стари MDR2 -/- мишки 61 3.5.1 Експресия на OPN в чернодробна тъкан 62 3.5.2 Експресия на остеокалцин в чернодробна тъкан 63 3.5.3 Експресия на OPG в чернодробна тъкан 64 3.5.4 Експресия на OPN в костна тъкан 65 3.5.5 Експресия на остеокалцин в костна тъкан 66
Съдържание 3.6 Експресия на гени в чернодробната тъкан на ензими и протеини, които регулират метаболизма на витамин D 67 4 Дискусия 69 4.1 Ограничения и перспективи 77 5 Резюме 80 6 Списък на фигури 82 7 Списък на таблици 83 8 Библиография 84 9 Приложение 94 9.1 Оптимизиране на оцветяването 94 9.1.1 Оцветяване с НЕ 94 9.1.2 MGT Оцветяване 95 9.2 Допълнителни хистологични изображения 96 9.3 Допълнителна информация за използваните праймери 98 9.3.1 β-актин 98 9.3.2 Остеокалцин 100 9.3.3 Остеопонтин 105 9.3.4 Остеопротегерин 107 9.3.5 MDR2 111 10 Благодарности 117
Списък на съкращенията 25 (OH) D 3 25-Hydroxycholecalciferol 1,25 (OH) 2 D 3 1α, 25-Dihydroxycholecalciferol PBC PBS PCR ph PSC PTH RANKL RNA RT RT-PCR sec SMI Taq TBE Tb.N Tb.Sp Tb.Th TGF -β TRAP TV и други UV V VDBP напр. първична билиарна цироза фосфатно-буфериран физиологичен разтвор полимеразна верижна реакция pondus hydrogenii първичен склерозиращ холангит паратиреоиден хормон рецепторен активатор за ядрен фактор κ B лига рибонуклеинова киселина стайна температура обратна транскриптаза полимеразна верижна реакция втора Структурен модел индекс включително ултравиолетови волта витамин D-свързващ протеин например
1 Въведение 13 Фиг. 1-5 Хипотетичен механизъм за регулиране на чернодробната остеодистрофия TGF-β като възможен регулатор Графични източници: http://www.servier.de/medicalart/skelett-und-knochen/?catselect=5; http://www.servier.de/medicalart/ arterien -ziologische /? catselect = 0; http://www.servier.de/medicalart/verdauungssystem/?catselect=7; 5 август 2011 г. 1.7 Алтернативен животински модел Като цяло няма точно проведени дългосрочни проучвания in vivo по темата за чернодробната остеопатия. В такъв случай популацията от пациенти (вид, продължителност, стадий на чернодробно заболяване; възраст, пол, съпътстващи заболявания
2 Материал и методи 22 1. Обезпаразитяване Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III 2 min 2 min Roticlear IV 2 min Roticlear V 2 min 2. Рехидратация 99,9% EtOH I 3 мин 99,9% EtOH II 3 мин 99,9 % EtOH III 2 мин. 90% EtOH 2 мин. 80% EtOH 2 мин., Т.е. 2 O 2 мин. 3-то оцветяване на разтвор на хемал, кисел съгласно Mayer 5 мин. Течаща чешмяна вода 15 мин. Разтвор на еозин G 0,5% воден 3 мин., Т.е. 2 O за кратко 4. Дехидратация 80% EtOH 30 сек. 90% EtOH I 4 мин. 90% EtOH II 4 мин. 99,9% EtOH I 3 мин. 99,9% EtOH II 5 мин. 5. Ясен Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 мин. 5 мин. 5 мин. 3 мин. Таблица 2-2 Протокол оцветяване с хематоксилин-еозин сек: секунда Резултатите от оцветяването са ядра на синьо-виолетови клетки, бледочервена цитоплазма, червени мускулни влакна, червено-оранжеви еритроцити и червена колагенова съединителна тъкан (вж. фиг. 2-1 ).
2 Материал и методи 23 Фиг. 2-1 Пример за оцветяване с хематоксилин еозин в черния дроб, женска MDR2 -/- мишка, седмица живот 5 2.3.1.5 Оцветяване и монтиране на трихром Masson-Goldner 2.3.1.5.1 Материал и оборудване Rotipuran 100% оцетна киселина p.a. ROTH (Cat-No.: 3738.4) EtOH 99.9%, 90%, 80%, 70% Разтвор на хематоксилин A съгласно Weigert Разтвор на хематоксилин B съгласно Weigert Apotheke des MRI ROTH (Cat-No: X906.1) ROTH (Cat-No .: X907.1) Светлозелен SF жълтеникав MERCK (Кат. №: 115941) Оранжев G MERCK (Кат. №: 115925) Poncau Xylidine FLUKA Chemie GmbH (Кат. №: 81465) Киселин фуксин FLUKA Chemie GmbH (Кат. № .: 84600) Тунгстофосфорна киселина хидрат кристално чист MERCK (Cat-No.: 100582) Roticlear ROTH (Cat-No.: A538) Обхват на магнитната пръчка Магнитна бъркалка MR Hei-Mix L Аналитична везна ROTH (Cat-No: C267.1) Heidolph Instruments, D-Schwabach Kern and Son GmbH, D-Balingen
2 Материал и методи 25 3. Киселин фуксин ponceau xylidines 0,2 грама (g) Ponceau xylidines 0,1 g киселина фуксин 300 ml ddh 2 O 0,6 ml 1% оцетна киселина 4. Фосфотунгстична киселина портокал G 12 g тунгстофосфорна киселина 3 g портокал G 200 ml ddh 2 O 5. светло зелено 0,3 g светло зелено SF жълтеникаво 200 ml ddh 2 O 0,4 ml 1% оцетна киселина Споменатото оцветяване е извършено съгласно протокол, разработен чрез оптимизация на цвета (вж. Глава 9.1 по-долу) (вж. Таблица 2-3) . След това оцветените, дренирани и изчистени секции бяха покрити с Roti-Histokitt II по същия начин като оцветените секции с HE. Сместа от хематоксилин А и В съгласно Weigert може да се съхранява максимум 8 дни при стайна температура. Резултатите от оцветяването са черно-кафяви клетъчни ядра, червена цитоплазма, светлочервени мускулни влакна, оранжево-червени еритроцити и зелена колагенова съединителна тъкан (вж. Фиг. 2-2). Фиг. 2-2 Пример за трихромно оцветяване на Masson-Goldner в черния дроб, женски MDR2 -/- мишка, възраст 44
2 Материал и методи 26 1. Обезпаразитяване Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III 2 min 2 min Roticlear IV 2 min Roticlear V 2 min 2. Рехидратация 99,9% EtOH I 3 мин 99,9% EtOH II 3 мин 99,9 % EtOH III 2 мин. 90% EtOH 2 мин. 80% EtOH 2 мин. 3-то оцветяване на хематоксилин по Weigert 4 мин. Течаща чешмяна вода 10 мин. Киселина фуксин-Понсо-ксилидини 2-4 мин. 1% оцетна киселина кратко Фосфотунгстична киселина оранжево G 5 мин. 1% оцетна киселина кратко Светло зелено 15 мин. 1% оцетна киселина 2 мин. 4. Дехидратация 80% EtOH 30 сек. 90% EtOH I 4 мин. 90% EtOH II 4 мин. 99,9% EtOH I 3 мин. 99,9% EtOH II 5 мин. 5. Clear Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 min 5 min 5 min 3 min Таблица 2-3 Протокол Masson-Goldner трихромно оцветяване
2 Материали и методи 28 Хематоксилин-еозин Masson-Goldner Tri. Етап I плюс 0 LRMCLRMC перидуктални съединителнотъканни отлагания 1-3 оток 1 портален възпалителен инфилтрат 1 етап II плюс 5 пролиферация на жлъчните пътища 1 перипортален възпалителен инфилтрат 1 портално-перипортална фиброза 1-5 некроза, изядена от молец 1 етап III плюс 13 атрофия на жлъчния канал 1 некроза на гръдния мозък 1 -3 IV плюс 18 скарификация на жлъчните пътища 1 билиарна цироза 1 резултат Таблица 2-4 Резултат за хистологична оценка 2.4 Определяне и оценка на стойностите на кръвните серуми 2.4.1 Определяне на ензимната активност 2.4.1.1 Материал, оборудване и софтуер Fluitest LDH-L тест комплект ANALYTICON Биотехнологии (Кат. №: 2222 ) Fluitest GOT/ASAT ANALYTICON Biotechnologies (Cat-No.: 1176) Fluitest GPT/ALAT ANALYTICON Biotechnologies (Cat-No.: 1186) LDH-Standard 0: NobiCalserum Multi Nobis/HITADO
de/min 2 Материал и методи 31 промени в абсорбцията, образувани за min. Тези средни стойности са нанесени в точкова диаграма на ординатата спрямо известните ензимни активности по стандарт на абсцисата. След това беше изчислена линейна регресионна линия на точковата диаграма, както и функцията, която я описва, и нейният коефициент на определяне. Измерената стойност за стандарт 8 съответства на празната стойност. Изчислената функция беше достъпна в следната форма: След решаване на формулата за x, периодът от 0 min до x min на всяка серумна проба беше използван за y. Определените по този начин х стойности съответстваха на ензимната активност на серумната проба, коригирана за празната стойност и бяха прехвърлени в таблици на Microsoft Excel, статистически оценени с помощта на GraphPad Prism и показани графично. 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0,05 0,05 Стандартна крива LDH y = 0,0027x - 0,0213 R² = 0,9987 0 20 40 60 80 100 120 140 Ензимна активност [U/l] Фиг. 2-3 Пример за стандартна крива LDH фотометрична оценка на стандартните разтвори на LDH, включително стандартите 3-7 2.4.2 Определяне на концентрацията на TGF-β 2.4.2.1 Материал, оборудване и софтуер Рекомбинантен човешки TGF-β 1 peprotech ( Каталожен номер: 100-21) Dulbecco s PBS (1) PAA Laboratories GmbH (Каталожен номер: H15-002)
de/min 2 Материал и методи 34 Приписването на нарастването на изчезване в минута към специфична концентрация на TGF-β е направено с помощта на стандартна крива (виж фиг. 2-4). За тази цел средните стойности на стандарт за известните концентрации на TGF-β 1 за стандарт са нанесени върху абсцисата в точкова диаграма на ординатата. Изчислява се линейната регресионна линия на точковата диаграма, както и функцията, която я описва, и нейният коефициент на определяне, като стойността, измерена за стандарт 8, съответства на празната стойност. Изчислената функция беше достъпна в следната форма: Стандартна крива TGF-β 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 y = 0,0033x + 0,0325 R² = 0.9803 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Концентрация [ng/ml] Фиг. 2-4 TGF-β стандартна крива фотометрична оценка на стандартните разтвори на TGF-β След решаване на формулата за x, периодът от време 0 min използвани до х min от всяка серумна проба. Определените по този начин x-стойности съответстваха на TGF-β концентрациите на серумната проба, коригирани за празната стойност и бяха прехвърлени в таблици на Microsoft Excel, статистически оценени с помощта на GraphPad Prism и показани графично.
2 Материал и методи 42 EtBr Glycerol SIGMA (Cat-No.: E1385-5ML) SIGMA (Cat-No .: G8773-500ML) peqgold Universal Agarose Peqlab (Cat-No .: 35-1020) puc19-marker ROTH (Cat- №: X901.1) Taq полимераза 1000 U Axon Labortechnik (Кат. №: 22466) Taq-Полимераза реакционен буфер 10 BD MgCL 2 dntp-смес 10 mm на нуклеотид Axon Labortechnik (Кат. №: 24478) Tris (хидроксиметил ) аминометан Mastercycler еп градиент PowerPac TM HC Захранване Gel ix Imager SIGMA (Cat-No.: T87602-3KG) Eppendorf AG, D-Hamburg Bio-Rad Laboratories GmbH, D-Munich Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen Intas Steuer Софтуер за събиране на изображения Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen 2.6.3.2 Принцип на PCR и гел електрофореза PCR е метод, който може да селективно амплифицира определени участъци от ДНК in vitro. За тази цел епруветките, пълни с cdna и реакционна смес, преминават през 40 цикъла в устройство като градиента на Mastercycler ep. Всеки цикъл се състои от 3 стъпки: 1. Денатурация При 95 ° С съществуващите водородни връзки между ДНК веригите или праймерите се разкъсват, така че са останали само единични вериги. По време на инициализацията тази стъпка се удължава с 5 минути, така че възможно най-много низове да бъдат прекъснати.