Стефани Робърт докторска дисертация по растителна биология - PDF безплатно изтегляне
Насочено отклоняване на клетъчния метаболизъм в дивия тютюн Nicotiana benthamiana, използвана като гостоприемник за хетероложна експресия на протеини от клиничен интерес Теза Стефани Робърт Докторат по биология на растенията Доктор по философия (PhD) Квебек, Канада Стефани Робърт, 2015
И накрая, не на последно място: благодаря на съпруга ми Стефан за неговата подкрепа и любов, въпреки всички тези вечери, нощи и почивни дни да работя, понякога да се отчайвам, но никога да не отстъпвам. Стефани х
До Стефан и Захарий, xi
Съдържание Резюме. iii Резюме. v Предговор. vii Благодарности. ix Съдържание. xiii Списък на таблици. xvii Списък на фигурите. xix Списък на съкращенията. xxi Общо въведение. 1 Глава 1. 3 Преглед на литературата. 3 1.1 Производството на рекомбинантни протеини. 5 1.1.1 Конвенционални производствени системи. 5 1.1.1.1. Бактерии. 5 1.1.1.2 Дрожди. 6 1.1.1.3 Животински клетки. 6 1.1.1.4 Яйца. 7 1.1.2 Растителна молекулярна култура: ефективна алтернатива за производството на рекомбинантни протеини. 7 1.1.2.1 Трансфекция на растителни клетки. 8 1.1.2.2. Стабилна трансформация, преходен израз. 9 1.2 Протеолиза, често пречка за получаване на задоволителни добиви в растителното молекулярно земеделие. 11 1.2.1 Нестабилност на рекомбинантните протеини в планта. 11 1.2.2 Стареене и протеолиза. 12 1.3 Стратегии за защита на рекомбинантните протеини в растителното молекулярно земеделие. 13 1.3.1 Стабилизиране на рекомбинантните протеини ex planta. 13 1.3.2 Стабилизиране на рекомбинантните протеини в планта. 14 xiii
4.5.8 Анализи на протеаза. 74 4.5.9 Количествено определяне на C5-1. 75 4.5.10 Статистически анализи. 75 4.6 Резултати и дискусия. 75 4.6.1 MeJA предизвиква ребалансиране на протеома на листа в N. benthamiana. 4.6.2 MeJA има малък ефект върху взаимодействието на N. benthamiana A. tumefaciens. 79 4.6.3 MeJA също има малък ефект върху протеазните дейности в трансфектираните листа. 4.6.4 Лечението с MeJA увеличава натрупването на преходно експресиран рекомбинантен протеин 83. 84 4.7 Заключения. 85 4.8 Благодарности. 86 4.9 Подкрепяща информация. 86 Глава 5. 95 Заключения и перспективи. 95 5.1. Обратно към хипотезите. 97 5.1.1 Основна хипотеза 1, за влиянието на етапа на развитие на листата върху добива на C5-1 антитяло. 98 5.1.2 Основна хипотеза 2, за влиянието на защитните пътища на растението гостоприемник върху добива на C5-1 антитяло. 99 5.2. В заключение. 101 Референции. 103 Приложение. 125 Глава на книгата. 125 xvi
Списък на таблици Глава 3 Таблица 3.1 Добив C5-1 (µg) на лист и на растение в растения от N. benthamiana, преходно експресиращи C5-1 самостоятелно или C5-1 със SlCys8 или SlCDI. 48 Таблица S3.1 Протеолитични активности (единици/сек) в цели листни и апопластични екстракти от листа на N. benthamiana шест дни след инфилтрация с Agrobacteria, съдържаща празен вектор, или с Agrobacteria, съдържаща експресионен вектор C5-1 или нефилтрирана. 57 Глава 4 Таблица 4.1 Свързани със стреса протеини, регулирани нагоре при N. benthamiana оставят 7 дни след лечението meja. 78 Таблица S4.1 Допълнение към таблица 1: Съчетани уникални пептиди за стрес-регулирани протеини, регулирани нагоре в N. benthamiana оставя 7 d лечение след meja. 88 Таблица S4.2 Препращащи и обратни олигонуклеотидни праймери, използвани за RT PCR тестове в реално време. 93 xvii
Списък на фигури Глава 1 Фигура 1.1 Схематично представяне на Ti плазмид (A), типичен двоичен вектор (B) и "помощник" плазмид (C), използван за трансформация. Взето от Pacurar et al., 2011. 10 Фигура 1.2 Стабилизиране на леките и тежки вериги на рекомбинантното антитяло C5-1 в агроинфилтрирани листа на Nicotianana benthamiana, преходно експресиращи SlCDI или SlCYS9. 18 Фигура 1.3 Взаимовръзка между метаболитните пътища, участващи в системна резистентност, индуцирана в растенията, зависимия от салициловата киселина (SA) път и зависимия от язмонова киселина (JA) път. 21 Глава 3 Фигура 3.1 Бинарни вектори за изразяване на C5-1, SlCYS8 и SlCDI. 40 Фигура 3.2 Характеризиране на биомасата от листата на N. benthamiana 44 Фигура 3.3 Основни протеолитични дейности в листата на N. benthamiana 46 Фигура 3.4 Ефект на ко-експресираните SlCYS8 или SlCDI върху натрупването на C5-1. 49 Фигура 3.5 Биологична активност на C5-1, изразена самостоятелно или заедно със SlCYS8 или SlCDI . 51 Фигура 3.6 Натрупване във времето на биологично активен C5-1, изразен самостоятелно или заедно със SlCYS8. 53 Фигура S3.1 Нива на активност на C5-1 по градиента на възрастта на листата. 58 xix
Списък на съкращенията AACT ADN; ДНК cDNA; cdna T-DNA; Т-ДНК ADP ANOVA РНК; РНК иРНК; mrna BTH CaMV CHO ELISA EV Fab HC HCl Ig JA LC MeJA MES NaCl nos WHO PBS PCR PDI PR RuBisCO RE; ER RSA α 1 -антихимотрипсин човешка дезоксирибонуклеинова киселина; дезоксирибонуклеинова киселина, допълваща ДНК; комплементарна ДНК трансферна ДНК; трансфер ДНК Аденозин дифосфат Дисперсионен анализ; анализ на дисперсията Рибонуклеинова киселина; РНК за пратеник на рибонуклеинова киселина; пратеник РНК Бензотиадиазол Карфиол Мозайка Вирус Клетъчни яйчници на китайски хамстер Ензимно свързан имуносорбентен анализ Имитация на инфилтрация с празен вектор Фрагмент антиген-свързваща Тежка верига (тежка верига) Хлороводород хлорид (хлороводород) Имуноглобулин Ясмонова киселина (жасмонова киселина) Лека верига (лека верига) ) Метил жасмонат (Метил жасмонат) 2- [N-морфолино] етансулфонова киселина Натриев хлорид (натриев хлорид) Нопалин синтаза Световна здравна организация Буфериран с фосфат физиологичен разтвор Полимеразна верижна реакция (полимеразна верижна реакция) Протеин дисулфид изомераза Патогенеза (протеин) Рибулоза- 1,5-биспосфатна карбоксилаза/оксигеназа Ендоплазматичен ретикулум; ендоплазмен ретикулум Придобито системно съпротивление xxi
RIS Индуцирана системна устойчивост SA Салицилова киселина (салицилова киселина) ScFv Едноверижен променлив фрагмент SD Стандартно отклонение SDS-PAGE Натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел електрофореза SE Стандартна грешка (стандартна грешка) SlCDI Домат катепсин D инхибитор; Solanum lycopersicum катепсин D инхибитор SlCYS8 Осма субединица на домати мултицистатин; Solanum lycopersicum мултицистатин осма субединица SlCYS9 Домати цистатин No. 9; Solanum lycopersicum Cystatin 9 SP Сигнален пептид (сигнален пептид) TEV Тютюн ец вирус TMB 3,3,5,5-тетраметилбензидин xxii