Сърдечно фенотипизиране на мишки с дефицит TASK-1 и Pannexin-1 - Безплатен PDF
Сърдечно фенотипизиране на мишки с дефицит на TASK-1 и паннексин-1 INAUGURAL DISSERTATION за получаване на степен Dr.med.vet в Катедрата по ветеринарна медицина в университета Justus Liebig Giessen Stella Schulte (родена Petrić)
Изпратено от Института по фармакология и токсикология на университета „Юстус Либих“ Гисен Руководител: проф. Д-р. Йоахим Гайер и от Клиниката по детска кардиология и пневмология към Университетската клиника в Дюселдорф Ръководител: проф. Д-р. Birgit Donner Сърдечното фенотипизиране на мишки с дефицит TASK-1 и pannexin-1 INAUGURAL DISSERTATION за получаване на степен Dr.med.vet в катедрата по ветеринарна медицина в университета Justus Liebig в Giessen, представено от ветеринарния лекар Стела Шулте (родена Петрич) от Freiburg Gießen 2016
С одобрението на катедрата по ветеринарна медицина на университета „Юстус Либиг” Гисен Декан проф. Д-р. Д-р Мартин Крамер Рецензент проф. Д-р Йоахим Гайер проф. Д-р Birgit Donner Disputation Day 10 май 2017 г.
Въвеждаща вълна пресича изоелектричната линия (Mitchell et al., 1998; Chaves et al., 2003; Swynghedauw and Aubert, 2003; виж Фигура 1.6). R R R R P S Q R R R R Край на T-вълната (край на реполяризацията) P S Фигура 1.6: Ръчно дефиниране на края на T-вълната с мишката. Модифициран от Mitchell et al., 1998 Пресичането на Т-вълната и изоелектричната линия се определя като края на реполяризацията. Q Физиологичният пулс в покой на мишката е около 550-620 удара в минута (мин -1; Takuma et al., 2001; Kass et al., 1998), което е значително по-високо от това при хората със средно 70 удара в минута (Doevendans et al., 1998; Silbernagel and Despopoulos, 2003). PR, RR, QRS и QT интервалите са съответно по-кратки при мишките. В обобщение може да се каже, че потенциалите за действие и анатомичната структура на сърцето, както и експресията на йонните канали на двата вида, се различават незначително един от друг, но по същество позволяват резултатите от изследванията да бъдат пренесени от мишки върху хора. Доколкото знаем, това със сигурност е най-добрата от всички възможни системи за основни изследвания в основата си. 9
Въведение 1.5.3 Използване, развитие и възможности на нокаутиращи мишки Предварителната работа за разработването на нокаутиращи мишки донесе на американеца Марио Капеки и двамата му британски колеги изследователи сър Мартин Еванс и Оливър Смитис Нобелова награда за медицина за 2007 г. Засега нокаутираните мишки са единствените същества, създадени в лабораторията, използващи трансгенни техники, при които един или повече гени са били успешно и специално изключени. Те губят своята функция и дават възможност на изследователите да направят заключения относно тяхната роля при (наследствени) заболявания. С нашите две линии за размножаване, мишките pannexin-1 и TASK-1, имаме такива нокаутиращи се мишки на разположение за експерименти. Въпреки това, последният въпрос за преносимостта на резултатите върху хората винаги остава. 10
Въведение 1.5.4 Производство на нокаутирани мишки 1. Клетъчна култура (ембрионални стволови клетки, ES) Фигура 1.7: Производство на нокаутирани мишки Модифицирано според Graw, 2007 Целевият вектор се трансфектира в клетъчна култура от ембрионални стволови клетки и хомоложна рекомбинация включени в ДНК на стволовите клетки. В резултат на разпространението на променените клетки най-накрая се създава клетъчна популация с променен ген, който се инжектира в миши бластоцисти. Тези бластоцисти се вмъкват в женски мишки чрез ембриотрансфер и се носят от тях.Рождените мишки носят или изключително нормален (див тип) генетичен материал, или като така наречените мозаечни мишки, половината са от див тип, а половината са генетично модифицирани. Последните са хетерозиготни. Обратното кръстосване с хетерозиготни мишки в крайна сметка води до хомозиготни нокаутиращи мишки. 11.
Въведение ES2-247 ES1-84 CE-395 CE-494 IS-169 CE-379 IS = Вътреклетъчна верига; ES = извънклетъчна верига; CE = карбокси терминален край (цифрите след всеки показват аминокиселинните позиции на трансмембранните домейни) Фигура 1.9: Структурно сравнение на трите различни гена на панексин на мишката Модифицирано според Penuela et al., 2009 Всички 3 гена на паннексин на мишката имат 4 трансмембранни домена (всеки с 20 аминокиселинни края) както и 2 извънклетъчни бримки и вътреклетъчен карбокси и амино терминален край. Крайният карбоксилен край на паннексин-2 е много по-дълъг от този на другите два паннексина. 1.6.2 Експресия и функция на паннексин-1 Панексин-1 е единственият от трите протеини на паннексин, който може да бъде открит повсеместно (Barbe et al., 2006); експресията му е особено силна в еритроцитите, ендотелните клетки и астроцитите, където те се освобождават от ATP (Wang et al., 2007). Експресията му в сърцето на мишката (Ray et al., 2005; Nishida et al., 2008) се увеличава чрез натиск (Nishida et al., 2008). В допълнение към сърцето на мишката, паннексин-1 се открива и в сарколемата на кучешки кардиомиоцити (Dolmatova et al., 2012). 15-ти
Въведение В допълнение към преходния и рефрактерния период, настоящата работа също има за цел да анализира уязвимостта на мишките TASK-1 +/+ и TASK-1 -/- in vivo, използвайки програмирани октаполярни катетри в електрофизиологично проучване (EPU), може да се определи интракардиална стимулация. 25-ти
Материал и методи 2 Материал и методи 2.1 Генотипизиране на мишки Pannexin-1 и TASK-1 WT и KO 2.1.1 Подготовка на ДНК от върховете на опашката ДНК подготовката с помощта на DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) се извършва от приблизително Безкостни върхове на опашката с дължина 3 mm, които бяха отстранени от мишките, когато бяха отбити едновременно с маркирането на ухото. Проба от тъкани Разтваряне на клетъчните стени Свързване на процеса на измиване на ДНК Фигура 2.1: Принцип на ДНК препарата, модифициран съгласно ръководството на DNeasy Blood and Tissue Kit По време на първия етап протеиназата К разтваря клетъчните стени и по този начин освобождава тяхната ДНК. След това различни буфери позволяват оптимално свързване на ДНК с DNEasy мембраната на специално доставените епруветки. Два процеса на измиване водят до факта, че неизползваемият материал и ензимните инхибитори се отстраняват и чистата ДНК може да се елуира готова за употреба. Елуиране Готовата за употреба ДНК чистота и концентрация на ДНК се определят фотометрично (NanoDrop 1000, Thermo Scientific, САЩ). 26-ти
Материал и методи видим пакет от Неговото възбуждане. Като правило това се вижда най-ясно при записи, в които амплитудата на предсърдното възбуждане е почти толкова висока, колкото тази на вентрикула. Възбуждането на неговия пакет Атриум (A) A Неговото начало: сигнал за атриум V Начало: вентрикуларна стимулация (V) Фигура 2.6: Измерването на неговия пакет в мишка pannexin 1 +/+. Засичане (запис на сигнал) с e3e4 Пакетът His може да бъде разпознат най-добре, когато амплитудите на предсърдното и вентрикуларното възбуждане са били също толкова високи по време на интракардиалния запис. Ако беше открит пакет от Неговото възбуждане, бяха записани шест последователни сърдечни удара за всяка мишка по отношение на AH (начало на предсърдно стимулиране до сглобяване на His), HV (пакет от Него до началото на вентрикуларна стимулация) и AV интервал (начало на предсърдието до Начало на възбуждането на камерата). Извършихме това на шест паннексин-1 и пет мишки TASK-1 от двата генотипа. Средните стойности на животно са оценени статистически. 38
Материал и методи 2.8 Телеметрични изследвания на мишки pannexin-1 +/+ и pannexin-1 -/- 2.8.1 Основи При мишките дългосрочните ЕКГ могат да бъдат записани само с помощта на предаватели, поставени подкожно или интраперитонеално. Те са добър начин за постигане на трудно поддържаната сърдечна честота в покой при мишки без влиянието на наркотици (Bernstein, 2003; Berul 2003). EKG сигналите се записват от два електрода, предават се на приемни плочи, филтрират се чрез матрица (и двете DSI Data Sciences, Минеаполис, САЩ) и накрая стават видими от компютърната програма (LabChart 7). Фигура 2.8: Нашите телеметрични предаватели Предавателите, имплантирани подкожно от нас (модел ETA-F10 от DSI). 1 Мъжки и женски паннексин-1 WT и нокаутиращи мишки на възраст 3-6 месеца и с тегло най-малко 23 g са използвани за подкожно имплантиране на приблизително 1,6 g тежък предавател (DSI Data Sciences, Минеаполис, САЩ) използвани. Както обикновено при гризачите, всички животни имаха свободен достъп до храна и вода, докато се предизвика анестезия. 1 http://www.datasci.com/products/implantable-telemetry/mouse-(miniature)/eta-f10 43
Материал и методи 2.8.2 Подготовка за имплантацията на предавателя Веднага след като животните достигнат стадия на толерантност към анестезия след интраперитонеално инжектиране на кетамин и ксилазин, ние ги фиксирахме в легнало положение върху затопляща плоча (HAT 007, Minitüb GmbH, Tiefenbach). Крайниците ви бяха прикрепени към последните с адхезивни ленти, докато ние обработвахме очите с предлаганите в търговската мрежа мазила за очи (напр. HYLO -Gel, Ursapharm, Saarbrücken), за да предпазим от дехидратация. Тестваните животни бяха снабдени с 0,5 l/min кислород (Linde AG, Pullach) и 1,5 об.% Изофлуран (Isofluran Actavis, Actavis, Мюнхен) чрез латекс противогаз. Те бяха на устройство за засмукване от плексиглас, специално създадено за тази цел и което трябваше да предотврати изтичането на въздух, съдържащ изофлуран. Фигура 2.9: Мишка на операционната маса Мишка на смукателното устройство от плексиглас и нагревателната подложка. Синьото парче латекс служи като противогаз. По време на тези препарати стерилният предавател и 1 ml смесена спринцовка, направена от 5% глюкоза и физиологичен разтвор, са предварително загряти на водна баня. 44
Материал и методи В края на разследванията мишките бяха убити, телеметричните предаватели отстранени и почистени и дезинфекцирани с помощта на разтвори Gigazyme и Gigasept (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt). 2.8.5 Записване на дългосрочните ЕКГ Аналогично на Kramer et al. (1998) започнахме да записваме 24-часовите ЕКГ десет дни след имплантирането на предавателя. За да не се предизвика дразнене или промени в поведението, животните остават в отделни клетки по време на записа. В дните на записа на EKG се полагаше грижата да се избягва необичайно излагане на хора и шумове в помещението за животни, така че обратният дневно-нощен ритъм да не се нарушава. Всички устройства, необходими за запис на ЕКГ, като лаборатория за захранване, компютър, монитор, записващи плочи, кутия и различни захранващи кабели, бяха добре дезинфекцирани, преди да бъдат внесени в съответната стая за животни (Incidin Liquid, Ecolab, Monheim). Данните са записани със софтуера LabChart 7 (ADInstruments, Spechbach) и честота на вземане на проби от 1 kHz. Компютър със софтуер за анализ Предавател Input-Matrix Receiver Фигура 2.11: Схематично представяне на дългосрочния ЕКГ запис Модифициран от Kramer, 2000 47
Материал и методи 2.8.7.1 Плуване Експериментите по плуване (SV) се разглеждат в експерименталната животинска медицина като движение с постоянно натоварване, което води до субмаксимално натоварване (Bernstein et al., 2003). След телеметричен запис на ЕКГ в покой в продължение на пет минути, животните плуваха поотделно още пет минути в клетка Makrolon с размер II (висока 15 cm, пълна с 37-39 C топла чешмяна вода). Ако отделни животни са били потопени поради изтощение, те са били подпомагани за кратко ръчно. EKG се записва по време на плуването и по време на 10-минутната фаза след тренировка, че мишките се връщат в клетките си. Фигура 2.12: Мишка по време на плуване с ръчна поддръжка За оценката разделихме опита за плуване на три фази, както следва: Таблица 1: Време на опит за плуване Фаза Продължителност (мин) Дейност 1 0 до 5 Почивка 2 5 до 10 Плуване 3 10 до 20 Възстановяване 2.8.7.2 Упражнение с бягаща пътека Постигането на физическо натоварване чрез работа на бягаща пътека се счита за златен стандарт с цел поддържане на контролиран сърдечно-съдов стрес при хора или други големи бозайници 49
Материал и методи Поддържане на скоростта на ходене със или без наклон и край, когато животните са изтощени (Desai et al., 1999; Kemi et al., 2002; Massett and Berk, 2005; Niebauer et al., 1999). Първият ни протокол за бягаща пътека I без наклон (виж табл. 2) беше ограничен до прав бягащ маршрут, по време на който скоростта непрекъснато се увеличаваше до появата на умора. Таблица 2: Протокол за бягаща пътека I без наклон Време (мин) Вторият протокол за бягаща пътека II с наклон е извършен най-рано 2 дни след първия, за да се осигури време за регенерация на животните. В допълнение към постоянното увеличаване на скоростта, наклони в 5 стъпки от 0 до 25 бяха въведени на всеки четири минути (вж. Таблица 3). Скорост (м/мин) Време (мин) Скорост (м/мин) 0 2 20 13 2 3 22 14 4 5 24 15 6 6 26 16 8 7 28 17 10 8 30 18 12 9 32 19 14 10 34 20 16 11 36 21 18 12 38 22 Таблица 3: Протокол за бягаща пътека II с наклон Време (мин) Скорост (м/мин) Настройка на рампата (градуси) Време (мин) Скорост (м/мин) Настройка на рампата (градуси) 0 2 0 16 10,2 20 2 3 "18 11.4" 4 3.3 5 20 12.5 25 6 4.5 "22 13.7" 8 5.6 10 24 14.8 "10 6.8" 26 15.9 "12 7, 9 15 28 16,5 "14 9,1" 30 17,7 "51
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ Непосредствено след настъпването на изтощение животните бяха върнати в клетките си и тяхната EKG беше регистрирана по време на 10-минутната фаза на възстановяване. Изминатото разстояние и скоростта по време на умора се отбелязват за всяка мишка. Фазата на възстановяване винаги е протичала под наблюдение и са били забелязвани всички аномалии. Фигура 2.14: Мишка върху права бягаща пътека Ако и двата протокола за бягаща пътека и свързаните с това фази за възстановяване приключат, животните са умъртвени чрез дислокация на шийката на матката. След това бяха използвани за определяне на телесните параметри. Както при теста за плуване, тестовете на бягащата пътека бяха разделени на три различни секции за оценка: Таблица 4: График на двата теста на бягаща пътека Фаза Продължителност (мин) Дейност 1 0 до 5 Почивка 2 5 до 10 Бягаща пътека 3 10 до 20 Възстановяване 52
Материал и методи Благодарение на високите честоти на кадрите и добрата пространствена разделителна способност, вече са възможни и ехокардиографски изследвания на сърцето на малката мишка с висок пулс. Ехокардиографията е извършена с Vevo 2100 (FUJIFILM Visual Sonics Inc., Торонто, Канада) и MS 400 линеен преобразувател с 18-38 MHz. 10 сърдечни удара бяха осреднени за всяка измерена стойност при 14 мишки с дефицит на паннексин-1 +/+ - и 12. Фигура 2.15: Ултразвуковото устройство, което използвахме 2 Всички мишки бяха изследвани чрез ехокардиография не по-рано от дванадесет дни след имплантирането на предавателя. 2.9.2 Извършване на ехокардиографията Индукцията на анестезия се извършва с 5% изофлуран (Изофлуран Актавис, Актавис, Мюнхен) и 0,5 l/min кислород (Linde AG, Pullach) и се намалява до 1,5% изофлуран, като кислородният поток остава постоянен За да се запази възможно най-малко влиянието на анестезиращия газ върху сърдечно-съдовата система. Животните трябва да са само неподвижни. За разследването мишките бяха поставени по гръб върху нагрятата плоча на Vevosystem, която беше предварително загрята до телесна температура, която също служи като плъзгаща се маса, 2 www.visualsonics.com/vevo2100 54
Положен материал и методи. За тази цел лапите й бяха фиксирани с лепяща лента върху сензорите за запис на EKG, главата й беше поставена в противогаза и телесната температура беше проследена с помощта на ректален сензор. За да запазим ултразвуковите изображения възможно най-без артефакти, обръснахме мишките си в областта на гърдите (Contura, Wella, Darmstadt). Фигура 2.16: Мишка по време на ехокардиография Тестваното животно лежи на маса за затопляне по време на ехокардиография и получава маска за анестезия (изофлуран) чрез маска. За целите на наблюдението крайниците му са прикрепени към ЕКГ сензори с адхезивни ленти и ректален сензор (син) отчита телесната температура. За по-добър преглед избрахме парастерналната дълга ос като първо изображение. При тази настройка бяха записани аортният поток, диаметърът на аортния пръстен на клапата, дължината на сърцето и М-режим за измерване на дебелината на стената. 55
Материал и методи Фигура 2.17: Измерване на диастоличната дължина на сърцето и вътрешната обиколка на сърцето в парастерналната дълга ос Зелено: Ръчно кръжене на ендокарда и измерване на дължината на сърцето в диастолата В допълнение, използвахме тази настройка за изчисляване на левокамерната сърдечна маса според метода с площ-дължина, което води до най-добри резултати при хора и мишки (Collins et al., 2001; Devereux et al., 1986). Дължината на лявата камера се измерва от ендокардиалния връх до митралния пръстен и се създава М-режим на ниво папиларен мускул (Collins et al., 2001). Със следващата втора настройка, късата ос, запазихме 3 различни равнини за рязане в B-режим в области на върха, центъра и основата. За да се направи това, ендокардът беше кръжен ръчно във всичките три режещи равнини в систолата и диастолата. Фигура 2.18: Къса ос в режим B (лява камера) Черно в средата = лумен на сърцето, около него светло сиво = ендокард, тъмно сиво = миокард 56 Дясна камера
Материал и методи 2.11 Статистически оценки Данните от всички експерименти са представени като средни стойности (MW) ± стандартно отклонение (SD) и идват от редица мишки (n), обяснени във всеки експеримент. В зависимост от това, което е подходящо за въпроса, статистическата значимост се изчислява с несдвоения t-тест, еднопосочната ANOVA или линейната регресия. С р-стойност от