Сравнително проучване на методите за доставка на лекарства, насочени към Булостомия на вътрешното ухо на мишката
Резюме
Представяме две минимално инвазивни микрохирургични техники при гризачи за доставяне на специфични лекарства в средното ухо, за да може то да достигне до вътрешното ухо. Първата процедура включва пробиване на тимпаничния мехур, наречен булостомия; втората е транстимпанична инжекция. И двете клинични процедури подражават на човешки интратимпанични.
Хитозан-глицерофосфатът (CGP) и буферът на лактат Рингер (RL) са били използвани като биосъвместими носители за локално доставяне на лекарства. CGP е нетоксичен, биоразградим полимер, широко използван във фармацевтични приложения. Това е вискозна течност при стайна температура, но тя се втвърдява в полутвърда фаза при телесна температура. RL е изотоничен разтвор, използван за интравенозно приложение при хора. Малък обем от това превозно средство е точно поставен над нишата на кръглия прозорец (RW) с помощта на булостомия. Транстимпаничната инжекция изпълва средното ухо и позволява по-малко контрол, но по-широк достъп до вътрешното ухо.
Профилите на двете техники за безопасност бяха проучени и сравнени с помощта на функционални и морфологични тестове. Изслушването се оценява чрез запис на реакцията на слуховия мозъчен ствол (ABR) преди и няколко пъти след микрохирургия. Нивото на цитоархитектура и запазване на кохлеарните структури са изследвани със стандартни хистологични техники във фиксирани и декалцифицирани параформалдехидни кохлеарни проби. Успоредно с това бяха взети необвързани кохлеарни проби и незабавно замразени, за да се анализират профилите на генна експресия на маркери на възпалението чрез количествена верижна реакция с обратна транскриптаза полимераза (qRT-PCR).
И двете процедури са подходящи като методи за доставяне на лекарство в средното ухо на мишки, въпреки че е показано, че инжектирането на тимпаностомия е по-малко инвазивно в сравнение с булостомия.
Въведение
Тук ние описваме и сравняваме двата хирургични метода, които са усъвършенствани за локално доставяне на лекарството до вътрешното ухо на мишки. Профилът на двете техники за безопасност е оценен с помощта на функционални, морфологични и молекулярни тестове. Слухът беше оценен с помощта на реакция на мозъчния ствол (ABR) 26, 27, извършена преди и след микрохирургия по различно време. Използвани са процедури с крайна точка за дисекция на кохлеята и сравняване на анатомичното, клетъчното и молекулярното въздействие на тези две микрохирургични процедури.
Протокол
Уверете се, че процедурите за боравене с животни са в съответствие с националните и международните разпоредби. Протоколът следва съответно насоките на Европейската общност RD 2010/63/EU и испански 53/2013.
Боравене 1. Обща информация за животните
-
Хранете мишките ad libitum със стандартна диета и питейна вода. Контролирайте здравето и благосъстоянието, като следвате Федерацията на научните асоциации на лабораторните животни (FELASA) __gVirt_NP_NNS_NNPS 9.
3. Подготовка на превозното средство
- Пригответе и използвайте на решения за превозни средства в на стерилни условия.
ЗАБЕЛЕЖКА: Течните разтвори обикновено се изчистват бързо през Евстахиевата тръба. Различни инжекционни системи за доставка могат да се използват за увеличаване на времето на престой на лекарството в средното ухо, включително хидрогелове и наночастици 32.- За приготвяне на CGP-хидрогел, разтварянето на 75% деацетилиран хитозан в 0,2 М оцетна киселина дава 1,5-2% (тегл./Тегл.) Разтвор на хитозан. Добавете 9% глицерофосфат (w/w) към този разтвор 7. Пригответе разтвора непосредствено преди приложението и съхранявайте хидрогела при 4 ° C до употреба.
ЗАБЕЛЕЖКА: CGP-хидрогелът е умерено вискозен, но все още се инжектира при тази температура. Под 4 ° C той се превръща в твърда фаза, блокирайки приложението му. След нанасяне CGP претърпява фазов преход към полутвърд гел при приблизително 15 минути при 37 ° C. - Аликвотен (0,5 ml) търговски RL буфер и се съхранява при 4 ° C до употреба.
- За приготвяне на CGP-хидрогел, разтварянето на 75% деацетилиран хитозан в 0,2 М оцетна киселина дава 1,5-2% (тегл./Тегл.) Разтвор на хитозан. Добавете 9% глицерофосфат (w/w) към този разтвор 7. Пригответе разтвора непосредствено преди приложението и съхранявайте хидрогела при 4 ° C до употреба.
4. Микрохирургични процедури
5. Морфологична оценка на кохлеарната цитоархитектура
6. Кохлеарна експресия на гени
Представителни резултати
Слухът е тестван от ABR преди и многократно след микрохирургия, за да се оцени въздействието върху функцията на слуха (фигура 1А). Регистри на ABR се извършват под анестезия, за да се предотвратят артефакти на движение и напрежение на животните и следователно да се подобри възпроизводимостта 27. Прилаганите интраперитонеално комбинации от инхалация на основата на кетамин или изофлуран обикновено се използват за обезболяване на животни по време на ABR тестване. Комбинацията кетамин/ксилазин осигурява краткодействаща (2-3 минути) индукция и стабилна, безопасна фаза на поддръжка, докато извършва ABR записи. Трябва да се отбележи, че изофлуранът може да повлияе на измерването на ABR чувствителността 38. За ABR регистрите субдермалните електроди се поставят на определени места. (фигура 1Б) и се измерва електрическия импеданс. Ако импедансът е 3 khms или повече, позиционирането на електрода трябва да се контролира, за да се избегнат промени в амплитудата на ABR вълната.