Smac миметиците индуцират некротично възпаление и смърт на туморни клетки чрез модулиране на
субекти
абстрактно
Макрофагите са пластмасови клетки, които се характеризират с различни състояния на активиране. 23 Класически активираните макрофаги (М1) и алтернативно активираните макрофаги (М2) представляват двете крайности в спектъра на фенотипа на макрофагите.Тумор-асоциираните макрофаги се класифицират като М2 макрофаги въз основа на техния профил на експресия на цитокини; 24 Те произвеждат високи нива на имуносупресивни цитокини като интерлевкин-10 (IL-10) и, най-вече при солидни тумори, споделят някои функции за възстановяване на тъканите с фибробластите. 23, 25 За разлика от тях, M1 макрофагите произвеждат големи количества провъзпалителни цитокини, включително интерферон-γ. (IFN & ggr;) и IL-12 и може да участва в задействането на ефективен антитуморен имунен отговор. Пластичността на макрофагите предлага нови терапевтични подходи, насочени към обръщане на M2 фенотип 26, особено при тумори, при които инфилтрацията на макрофаги като карцином на яйчниците играе съществена роля. Съответно, при модел на асцит на яйчниците на мишки, макрофагите се определят чрез модулиране на NF- & kgr; B сигнализация препрограмирана. 27
Наскоро описахме синтеза на нови димерни молекули, насочени към XIAP, cIAP1 и cIAP2. 28, 29 Една от тези молекули, SM83, инхибира растежа на SM-чувствителния аденокарцином на човешката гърда MDA-MB231 и рабдомиосаркома Kym-1, но не и на други клетъчни линии. Тук използваме два миши ксенографтни модела на раков асцит, за да покажем, че SM83, когато се прилага в монотерапия, увеличава преживяемостта на тези мишки, като насочва тумор-свързани макрофаги. Чрез TNF SM83 бързо предизвиква некроза на интраперитонеално (ip) инжектирани ракови клетки, които иначе са напълно резистентни in vitro към антитуморалните ефекти на SM83. Нашата работа показва, че SM83 има различни механизми на действие in vitro и in vivo и че упражнява антитуморната си активност in vivo чрез стимулиране на имунната система.
Резултати
SM83 сенсибилизира клетъчната линия на карцинома на яйчниците IGROV-1 към апоптотичните ефекти на TRAIL
SM83 предизвиква апоптоза in vitro, когато се комбинира с TRAIL. ( а ) Химична структура на димерния SM SM83. ( б ) IGROV-1 клетките получават 0, 1 или 1, 0 ц M SM83, третиран самостоятелно или в комбинация с 2 или 10 ng/ml TRAIL. Клетъчният растеж се изразява като процент по отношение на третираните с носител клетки. Стойностите са средната стойност и SD от експеримент, който е представителен експеримент от три проведени експеримента. ( ° С и д ) Western blot анализ на XIAP, cIAP1, cIAP2 и разцепен PARP (Cl PARP) в клетки IGROV-1, третирани със SM83 ( ° С ) или SM59 (SM-164) ( д ) Обработени в отсъствие или присъствие на 10 ng/ml TRAIL. Актинът е показан като контрол на зареждането. Стрелка, специфична XIAP лента
SM за монотерапия увеличават преживяемостта на мишки с раков асцит
След това SM83 и SM59 бяха тествани in vivo, използвайки миши ксенографтен модел, при който IGROV-1 клетки се инжектираха ip в атимични голи мишки, което води до асцит и смърт. Лечението както с SM83 (2a), така и с SM59 (2b) увеличава оцеляването на мишките (P.
Лечението със SM83 при монотерапия увеличава преживяемостта на мишки с раков асцит. ( а ) Голи мишки се инжектират ip с IGROV-1 клетки и се оставят нетретирани (O) или третирани 5 пъти седмично в продължение на 2 последователни седмици от деня след инжектирането с 5 mg/kg SM83 (l), 2,5 mg/kg TRAIL ( ∇) или със същата доза SM83 и TRAIL заедно (▪). Показан е експеримент, представляващ два извършени. Всяка обработена група съдържа седем мишки. Крива на оцеляване за третирани със SM83 мишки и контроли. ( б ) Крива на оцеляване за третирани със SM59 и контролни мишки. Необработени (○) или третирани със SM SM59 (∇). ( ° С Образуването на асцит се проверява чрез проследяване на телесното тегло на 17-ия ден. ( д и д ) Meth A клетки се инжектират в мишки BALB/c и се третират с 5 mg/kg SM83 дневно от 7-ия ден. ( д Образуването на асцит се проверява чрез проследяване на телесното тегло на 13 ден. Хоризонталната линия представлява средната стойност. ( д ) Крива на оцеляване за нелекувани () или третирани с SM83 () мишки от ден 7
За да тестваме дали in vivo активността на SM83 е специфична за клетъчна линия или ограничена до имунодефицитни мишки, използвахме друг модел на асцит, при който саркомни клетки на миши Meth A се инжектират ip в имунокомпетентни сингенични мишки BALB/c. Подобно на клетките IGROV-1, клетките на Meth A не инхибират растежа от SM83 in vitro (данните не са показани). При мишки SM83 намалява прогресията на асцита, което се счита за по-малко увеличение на телесното тегло (2d), и увеличава средното време на оцеляване от 15 дни за нелекувани животни на 26 дни (P = 0,0721; 2e). И в този модел комбинацията с TRAIL не беше изгодна (данните не са показани). Когато на мишки, излекувани със SM83 (4 от 14 тествани мишки), беше поставена нова инжекция от 4 × 10 5 Meth A клетки (два пъти повече от първото приложение), без нов асцит (данните не показан). Тези резултати предполагат, че тези животни са развили адаптивен имунитет.
SM83 бързо убива раковите клетки, плаващи в асцит, чрез неапоптотичен механизъм
За да се изследва механизмът на активността на SM83 in vivo, асцитна течност се събира от мишки, инжектирани с IGROV-1 клетки и се третират със SM83 в продължение на 3, 6 или 24 часа, и се броят туморни клетки. Резултатите показаха забележително намаление (P.
За да разберем механизма на клетъчната смърт, отговорен за намаляването на броя на плаващите туморни клетки в асцита, изследвахме експресията на медиатори на апоптоза в тези клетки в различни времеви точки. След 24 часа лечението с SM83 доведе само до леко увеличение на разцепения PARP, няма данни за разцепена активна каспаза-8 (което се очакваше, тъй като тези клетки се убиват от SM монотерапия in vivo) и само незначителен ефект върху разцепването на каспаза -3 (Фигура 3d). За разлика от това, клетките, третирани с TRAIL, показват по-голямо активиране на тези апоптотични маркери, въпреки че TRAIL е неефективен при намаляване на броя на асцитните клетки (допълнителна фигура S1). В опит да се открият апоптотичните събития, Western blot беше извършено върху клетките, събрани след 3 и 6 часа лечение (3е). И в този случай SM83 причинява пълното разграждане на cIAP1 и cIAP2, но има само слабо натрупване на разцепените форми на PARP, каспаза-8 и каспаза-3. Това ниско активиране на апоптотичната каскада показва, че причината за смъртта на асцитните туморни клетки не е предимно апоптотична.
За да оценим възможността, че автофагията - друг механизъм, който може да доведе до клетъчна смърт при необичайно и продължително активиране - е отговорна за загубата на асцитни туморни клетки, измерихме нивата на Beclin-1 и разцепихме LC3B. Лечението със SM83 не повишава нивата на тези протеини (допълнителна фигура S2), което предполага, че автофагията не участва в SM83-индуцирана смърт на туморни клетки.
SM83 предизвиква възпалително събитие in vivo
Лечението SM83 индуцира експресията на възпалителни цитокини in vivo. Голи мишки се инжектират ip с IGROV-1 клетки и се третират с единична доза от 5 mg/kg SM83 или не; Асцитът се събира 3, 6 и 24 часа след приложението на SM83. ( а ) SM83 временно увеличи нивото на TNF на мишката, измерено чрез ELISA. ( б ) Лечението с SM83 намалява броя на асцитните клетки, но този ефект се блокира, когато TNF се секвестира с по-високата доза етанерцепт (P = 0,0118 в сравнение с лечението само със SM83). ( ° С ) Western blots на асцитен туморен клетъчен протеин от нетретирани мишки и мишки, третирани със SM83 самостоятелно или в комбинация със 150 mg/kg етанерцепт. Стрелка, специфична лента за XIAP. ( д - З. ) Резултати от ELISA за IL-1? ( д ), IFN-? ( д ), IL-10 ( е ), трансформиращ растежен фактор & bgr; (TGF-?) ( G ) и IL-4 ( З. ) в асцитната течност от мишки, третирани както по-горе. Резултатите за IL-10 са показани като кратна индукция поради липсата на рекомбинантен протеинов стандарт
SM83 насърчава активирането на макрофаги към M1-подобен фенотип
Лечението с SM активира макрофагите и ги сенсибилизира до некротична смърт. ( а и б ) BALB/c BMDM (5 × 105) се посяват в 96-ямкови плаки, оставят се да залепнат за 16 h и се инжектират с 1 μl до 24 h. M SM83 лекуван или не. Лечението SM83 насърчава секрецията на възпалителните цитокини TNF ( а ) и IL-1β ( б ). ( ° С ) NF-? B активиране от SM83, оценено в RAW на макрофагите на клетъчна линия, стабилно трансфектирано с NF-? B-луциферазен репортерен ген. Показан е представителен експеримент от два проведени. Стойностите са средни и SD; n = 3. ( д и д ) BALB/c BMDM се посяват в плаки с шест ямки, оставят се да залепват в продължение на 16 часа и се третират със серийни разреждания на SM83 в отсъствие или присъствие на некростатин-1 или z-vad-fmk, за да се инхибира съответно некроптозата или апоптозата. ( д) Представителни изображения, показващи клетъчна морфология след 24 часа лечение. ( д ) Клетъчна жизнеспособност след лечения, оценени с помощта на анализа CellTiter-Glo
За да се изключи възможността IL-1, индуциран от SM83? Секрецията се дължи на замърсяване с липополизахариди (LPS), подготвихме BMDM от нокаутиращи мишки TLR4 (KO) и установихме, че IL-1? се секретира в подобна степен, както се секретира от клетки BALB/c (допълнителна фигура S4). Освен това беше установено, че SM83 препаратите за инжектиране не съдържат откриваеми количества LPS в теста Endosafe PTS (Charles River Laboratories, Calco, Италия) (данните не са показани). Тези резултати показват, че индуцираният от SM83 IL-1? -Производството не се дължи на замърсяване с LPS.
Натрупване на неутрофили от асцит от странични наблюдатели
След това неутрофили бяха изолирани от далаците на мишки с BALB/c (див тип) и дефицит на TNF рецептор 1 (TNF-R1), за да се изследва ролята на неутрофилите за антитуморната активност на SM83 in vitro. В анализите на Transwell миграцията на неутрофили от див тип към асцит от третирани със SM83 мишки е по-голяма от тази на нетретирани мишки (6d). HMGB-1 инхибиторът частично намалява миграцията, докато неутрофилите от мишки с дефицит на TNF-R1 не мигрират в отговор на асцит от третирани със SM83 мишки. Асцит от мишки, лекувани с активирани от SM83 неутрофили от див тип, за да произвеждат супероксид дори в присъствието на TNF блокера етанерцепт, докато глициризин напълно блокира тази активност (6е). Тези резултати предполагат, че миграцията на неутрофили в присъствието на асцит от третирани със SM83 мишки се стимулира от TNF, докато активирането се дължи на HMGB-1. Значението на TNF за миграцията на неутрофили също е демонстрирано in vivo, където предварителната обработка с етанерцепт блокира набирането на тези клетки в асцита (допълнителна фигура S5).
В обобщение, нашата работа показва, че SM83 действа in vivo при раков асцит, като превръща макрофагите от М2-подобен фенотип, който поддържа тумора, в М1-подобен фенотип, който е надарен с противотуморна активност. М1 макрофагите секретират цитокини като TNF, IL-1? и IFN? причиняване на бърза TNF-зависима некротична смърт на асцитни ракови клетки (7); След това умиращите клетки освобождават HMGB-1, който заедно с TNF стимулира масивна неутрофилна инфилтрация.
Предложен механизъм на действие на SM83 при раков асцит. SM83 стимулира обръщането на макрофагите от M2 към M1 фенотипа. TNF, секретиран от M1 макрофаги, предизвиква некротична смърт на раковите клетки в асцитната течност; Умиращите клетки освобождават HMGB-1, който заедно с TNF набира неутрофили
дискусия
В това проучване ние описваме in vivo активността на новосинтезиран SM SM83 в два ксенографтни модела за раков асцит при мишки. Ние показваме, че SM83 е ефективен като монотерапия in vivo върху човешки и миши ракови клетки, които са устойчиви на SM in vitro, и показваме, че тези клетки умират чрез неапоптотичен, TNF-зависим механизъм. Ние също така предоставяме доказателства, че SM83 си върши работата, като предизвиква възпаление и активиране на имунните клетки, което води до имуногенна смърт на раковите клетки. В допълнение, нашето проучване показва, че активността на SM83 (и вероятно други SM) в комплекса in vivo среда се различава от вече наблюдаваната in vitro.
В туморна микросреда, включително рак на яйчниците, макрофагите придобиват М2-подобен фенотип. 38, 39 Независимо от това, някои автори са предложили различни стратегии 23, 24, които могат да обменят състоянието на макрофагите в посока на ефективен антитуморен отговор. В този контекст беше показана и възможността за повишаване на ефективността на стандартните терапии, които нарушават М2 макрофагите, особено при тумори, чиято прогресия разчита строго на тяхната подкрепа, като карцином на яйчниците. Тези тумори създават сложна връзка със свързаните имунни клетки в асцита, 41 и развиват имуносупресивна микросреда, произведена от макрофаги. Следователно при рак на яйчниците реполяризацията на макрофагите или инхибирането на тяхното набиране може да бъде нова ефективна терапевтична стратегия.
Нашите резултати предполагат, че SMs регулират имунния отговор на асцит от рак чрез поляризиране на макрофагите и по този начин имат терапевтичен потенциал. Всъщност Smac/DIABLO 42 и показаният тук миметик SM83 предизвикват некротична или некротична клетъчна смърт. Некротичните клетки, различни от апоптотичните, освобождават неоксидирана, имуногенна форма на алармин HMGB-1 43, която активира дендритните клетки чрез активиране на рецептори за крайни продукти за гликиране, TLR4, TLR7 и TLR9 рецептори. 44 В допълнение, некротичните клетки могат да тренират CD4 + Т клетки, които са от съществено значение за развитието на адаптивен имунен отговор. 45 Възможността за адаптивен имунен отговор да бъде предизвикан от SM83-индуцирана некроза се увеличава от нашите резултати при използване на BALB/c имунокомпетентни мишки с мет-А асцит. Някои от тези мишки са излекувани чрез лечение със SM83 и не развиват допълнително асцит, когато са изложени на нова двойна доза клетки от Meth A, което предполага, че те са имунизирани срещу клетки от саркома на Meth A.
В обобщение, нашите данни показват, че SM83 е активен в монотерапията, като насърчава възпалението и имуногенната клетъчна смърт. Тези наблюдения дават обяснение защо SM повишава ефективността на стандартните терапии чрез стимулиране на имунната система. И накрая, доказателствата, че SM може да предизвика възпалителен отговор и да активира имунната система, дават интерпретация защо SM може да бъде по-ефективен in vivo, отколкото in vitro, 11, 46 и нашите резултати при убиване на раковите клетки.