Регулация на актиновия цитоскелет в панкреатичните ацинови клетки от тирозин киназата Да - PDF

Катедра по вътрешни болести в Университета в Улм I ръководител проф. Г. Адлер Регулиране на актиновия цитоскелет в панкреатичните ацинови клетки от тирозин киназата

актиновия

Изпълняващ длъжността декан: проф. Klotz 1. Докладчик: PD Dr. Lutz 2-ри репортер: Dr. Денят на докторантурата: 20 декември 2002 г.

Посвещение на моите родители, които винаги подкрепяха мечтите ми

Съдържание 1 СЪДЪРЖАНИЕ СЪДЪРЖАНИЕ. 1 СЪКРАЩЕНИЯ. 3 1. ВЪВЕДЕНИЕ. 5 2. ЦЕЛ. 19 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ. 20 3.1. Материал и животни. 20 3.1.1. АНТИТЕЛО. 3.1.2. ХИМИКА. 21 3.1.3. ЖИВОТНИ. 21 3.2. Методи. 22 3.2.1. ИЗОЛИРАНЕ НА АЗИНИ ОТ ПЪТЪЧНИ ПАНКРЕИ. 22 3.2.2. ИЗСЛЕДВАНИЯ ЗА СЕКРЕТИРАНЕ НА АМИЛАЗА В СВЕЖО ИЗОЛИРАН ПЛЪХ АЗИНИ. 23 3.2.3. ИМУННО ФЛУОРЕСЦЕНТНО ПЕТЛЕ. 23 3.2.4. ПРОИЗВОДСТВО НА ПРОТЕИНОВИ ЕКСТРАКТИ. 24 3.2.5. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КОНЦЕНТРАЦИЯ НА ПРОТЕИНА. 25 3.2.6. ПОДКЛЕТЧНО ФРАКЦИОНИРАНЕ. 26 3.2.7. ИМУНРЕЦИПИТАЦИЯ. 27 3.2.7. ГЕЛ ЕЛЕКТРОФОРЕТИЧЕН АНАЛИЗ НА ПРОТЕИНИТЕ ПО SDS-PAGE. 28 3.2.8. ЗАПАДНО БЛОТИРАНЕ. 29 3.2.9. ОТКРИВАНЕ НА ПРОТЕИНИ С АНТИТЕЛИ. 29 3.2.10. ИНДИЯ ИНЖИНГ. 30 3.2.11. КИНАЗНА ДЕЙНОСТ ДА. 31 3.2.12. ДЕНЗИТОМЕТРИЧНА ОЦЕНКА НА ИМУНОБЛОТИТЕ. 32 3.2.13. ИЗОЛИРАНЕ НА РНК ОТ АЗИНИ. 32 3.2.14. ПРОВЕРКА НА ЧИСТОТА И КАЧЕСТВОТО НА РНК. 32 3.2.15. ХИБРИДИЗАЦИЯ НА ГЕНОВИТЕ МАСКИ. 34 4. РЕЗУЛТАТИ. 37

Съдържание 2 4.1. Регулация на протеиново ниво. 37 4.1.1. ИЗРАЗЯВАНЕ НА ПРОТЕИНИ НА КИНАЗИТЕ НА SRC. 37 4.1.2. ТИРОЗИН ФОСФОРИЛИРАНЕ ОТ ДА ДО СТИМУЛИРАНЕ НА CCK. 38 4.1.3. ДЕЙНОСТ В КИНО ДА. 41 4.1.4. ЛОКАЛИЗАЦИЯ И РАЗПРЕДЕЛЕНИЕ ДА. 44 4.1.5. СЪОТВЕТСТВИЕ МЕЖДУ АКТИННОТО РАЗБИВАНЕ И ДА ДЕЙНОСТ. 46 4.1.6. СЕКРЕТИЯ ОТ ИЗОЛИРАН АЗИНИ. 49 4.1.7. ДА-СВЪРЗАНИ ПРОТЕИНИ. 51 4.2. Генната експресия. 53 4.2.1. ИЗПИТВАНЕ НА КОНЦЕНТРАЦИИТЕ ЗА ИЗОЛИРАНЕ НА РНК. 54 4.2.2. ГЕННО ИЗРАЗЯВАНЕ СЛЕД СТИМУЛИРАНЕ С CCK. 55 5. ДИСКУСИЯ. 60 5.1. Регулиране на протеините. 60 5.2. Диференциална генна експресия. 66 6. РЕЗЮМЕ. 69 7. СПИСЪК НА ЛИТЕРАТУРАТА. 71 ПРИЛОЖЕНИЕ. 83

Съкращения 3 Фигура Фигура Фигура Двойно дестилирана вода BSA Говежди серум Албумин CCK Холецистокинин CCK-R CCK Рецептор ECM Извънклетъчна матрица и др. Експеримент Експеримент FAK Фокална адхезия Киназа g Gramm IB Имуноблот IF Имунофлуоресценция IgG Имуноглопренулин G IP Имуноглобулин G IP Имуноглобулин G IP + Лека (и двете вериги на IgG) HRP хрян пероксидаза (хрян пероксидаза) kda килодалтон kg килограм M молар мин минута mk моноклонален ml милилитър µg микрограм N нормален nm нанометър nm наномоларен PBS фосфатно буфериран физиологичен разтвор PMSF фенилметилен сулфонил флуорид pk

Съкращения 16:00 пикомоларен PVDF поливинилиден дифлуорид Pyk2 богата на пролин тирозин киназа 2 RT стайна температура SDS натриев додецил сулфат SEM стандартна грешка SH Src хомология TBS Трис-буфериран солев разтвор Tyr тирозин напр. например

1. Въведение 12 Adherens кръстовище (Ohkubo et al. 1999). p120ctn не участва пряко във взаимодействието протеин-протеин със системата на актиновите нишки, тъй като не може да се свърже с α-катенин. Един от възможните механизми за регулиране на протеините на зонула адхеренс е фосфорилирането на тирозин, тъй като β- и γ-катенинът, както и p120ctn, могат да бъдат тирозин фосфорилирани чрез стимулиране с растежни фактори (Hazan et al. 1998; Rosato et al. 1998). P120ctn стабилизира клетъчно-клетъчната адхезия чрез свързване с Е-кадхерин (Yap et al. 1998); това се инхибира от хиперфосфорилирането на p120ctn по време на митоза (Hazan et al. 1998). Тирозиновото фосфорилиране на катенините може да играе ключова роля за стабилността или нестабилността на прилепналите зонули и по този начин закрепването на системата от актинови нишки с плазмената мембрана (Behrens et al. 1993). В проучвания при изолирани ацини също се наблюдава промяна в степента на фосфорилиране на p120ctn след стимулация с надмаксимални секреторни концентрации на CCK (Leser et al. 2000).

1. Въведение 14 FAK и въпросният паксилин. И трите протеина са описани като субстрати за Src киназите в други клетъчни системи (Calautti et al. 1998); (Schlaepfer et al. 1999; Shen et al. 2001). Семейството на Src кинази включва 9 протеина с подчертана структурна хомология. Повечето от киназите от семейство Src се експресират изключително в хемопоетични клетки, където те често са излишни, както е показано в нокаутиращите модели (Smith et al. 2001). От друга страна, Src киназите Yes, Lyn, Fyn и Src са повсеместно изразени и изглежда, че поемат различни роли (Thomas et al. 1995). Src киназите първоначално се локализират в цитоплазмата и като активни ензими се свързват почти изключително с клетъчните мембрани. Въз основа на хомологии на последователността могат да бъдат разграничени общо шест функционално значими домейни с различни задачи (фиг. 3). (Браун и др. 1996)

1. Въведение 17 на сгънатия протеин и не може да бъде фосфорилиран (Gonfloni et al. 2000). Свързването на субстрати към домейна SH2 също е трудно. Има няколко опции за активиране на Src киназите: Дефосфорилиране на Tyr 527 чрез конкурентно свързване на фосфатаза на високоафинитетен субстрат с SH2 или SH3 домейн, при което фосфорилираният Tyr 527 е изместен алостеричен активатор или модификация на протеина (например серин/треонин фосфорилиране), който е затвореният Конформацията дестабилизирана. Във всички случаи протеинът се разгръща и е възможно автофосфорилирането на киназния домен (Фиг. 4). Това активира киназата. Csk е описан като отрицателен регулаторен протеин, който е отговорен за фосфорилирането на Tyr 527 (Brown et al. 1996).

1. Въведение 18 PTyr 527 Tyr 527 неактивен активен Фиг. 4: Регулиране на активността на Src киназите. В неактивна форма (вляво) протеинът е в силно сгънато състояние. В активната форма SH3 домейнът се отделя от богатата на пролин спирала и SH2 домейнът вече не се свързва с опашната област (сега с нефосфорилиран тирозинов остатък). Активната страна се свързва с АТФ (червено), който поддържа фосфатната група готова за активиране. Първата реакция е фосфорилирането на остатъка от тирозин точно до мястото на свързване на АТФ (автофосфорилиране). Когато този тирозин се фосфорилира, ензимът се активира максимално. (след Godsell 2001)

3. Материал и методи 20 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ 3.1. МАТЕРИАЛ И ЖИВОТНИ 3.1.1. Антитела Следващата таблица (Таблица 2) показва всички използвани първични антитела/антисеруми и техните източници. Обозначение Видове Производител IB IP IF Да Мишка, mk Трансдукция 1: 5000 Pyk2 мишка, mk Трансдукция 1: 1000 Pyk2 заек, Biomol, pk Хамбург Фосфотирозин (PY20) мишка, mk Трансдукция 1: 2500 Src мишка, mk UBI 1: 200 Fyn заек, pk UBI 1: 500 Lyn Hase, pk Santa Cruz 1: 500 FAK мишка, mk Трансдукция 1: 1000 P120ctn мишка, mk Трансдукция 1: 1000 3 5 µg, за 350 750 µg протеин 5 µg за 750 µg протеин 5 µg за 650 µg Протеин 1: 1000 1: 200 Таблица 2: Първични антитела Всички вторични антитела, съчетани с пероксидаза, са получени от Pierce. За имунофлуоресцентното оцветяване бяха получени Alexa 488 куплирани вторични антитела от Molecular Probes (Eugene, USA) и Cy3 куплирани вторични антитела от Dianova (Хамбург).

3. Материал и методи 21 3.1.2. Химикали Наименование Аминокиселини (несъществени, MEM 100x) CCK-8, сулфатирани (CCK 25-32) Колагеназа, (CLSPA) L-глутамин Орегон Зелено-фалоидин говежди серумен албумин (BSA) Соев трипсин инхибитор Производител Life Technologies, Карлсруе Бахем, Бутингендорф, Швейцария, Cell Systems, Hamburg Life Technologies, Karlsruhe Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Fluka, Buchs Boehringer, Mannheim Таблица 3: Вещества Освен ако не е посочено друго в текста, всички други химикали са изброени на стр. А. или ултра чисто качество от производителите Fluka (Buchs), Merck (Франкфурт), Roth (Karlsruhe) и Sigma (Deisenhofen). 3.1.3. Животни Експерименталните животни са мъжки плъхове Wistar от инбредния щам WAG/RijCrl (Charles River, Sulzfeld). Те са били държани в групи с максимум 3 плъха на клетка при контролирани светло-тъмни условия, с 12-часова тъмна фаза между 19:00 и 7:00 сутринта. Стаите бяха климатизирани (21 C стайна температура, 55% влажност). Животните бяха хранени с диета за отглеждане и отглеждане Altromin ad libitum. В експериментите използвахме плъхове с тегло 100-200 g, които бяха на гладно през нощта.

3. Материали и методи 24, блокирани в PBS. Първичните антитела (в PBS) се инкубират или в продължение на 1 час при стайна температура, или в продължение на една нощ при 4 С. Слайдовете след това се промиват три пъти с PBS. Инкубацията с вторично флуорохром-свързано антитяло или с 0.2 µm Oregon Green конюгиран фалоидин се провежда в продължение на два часа на тъмно при стайна температура. След това предметните стъкла се измиват три пъти, преди ацините да бъдат вградени в Mowiol (Calbiochem, Bad Soden) и нанесени върху предметните стъкла. Анализът на имунофлуоресцентното оцветяване се извършва с конфокален лазерен сканиращ микроскоп (TCS 4D, Leica, Heidelberg). 3.2.4. Производство на протеинови екстракти В зависимост от проблема са използвани следните лизисни буфери. Дезоксихолат/буфер за лизин от тритон: Tris/HCl, pH 7,5 50 mm NaCl 150 mm EGTA 1 mm EDTA 0,4 mm Triton X-100 1% дезоксихолат 1% (тегл./Об.) Na ортованадат 0,5 mm Na- Флуорид 5 mm соев инхибитор на трипсин 1 mg/ml PMSF 1 mm апротинин 1,4 µg/ml левпептин 10 µg/ml Този буфер се използва за анализ на тирозин-фосфорилирани протеини и определяне на киназната активност.

3. Материал и методи 25 DTT/Triton X-100 лизисен буфер (съгласно Antibody Array, Biocat, Heidelberg): Tris/HCl, pH 7,5 15 mm NaCl 120 mm KCl 25 mm EGTA 2 mm EDTA 2 mm DTT 0,1 mm Triton X-100 0,5% Na ортованадат 0,5 mm Na флуорид 5 mm соев инхибитор на трипсин 1 mg/ml PMSF 1 mm апротинин 1,4 µg/ml левпептин 10 µg/ml Този буфер се използва за ко-имунопреципитация използваните протеинови комплекси Yes-Pyk2. Съответните стимулации бяха спрени чрез добавяне на ледено студен KRH буфер и след това клетките бяха гранулирани при 500 х g. След това супернатантата се изсмуква и ацините се ресуспендират в 200 400 μl лизисен буфер и се хомогенизират с ултразвук за 5 секунди. Последващата инкубация върху лед продължи 30 минути за изолиране на протеиново-протеинови комплекси и 10 минути за всички останали изолации. Неразтворимите се гранулират чрез центрофугиране в продължение на поне 20 минути при 10,000xg при 4 ° С. 3.2.5. Определяне на концентрацията на протеин Съдържанието на протеин в екстрактите се определя съгласно модифициран метод на Брадфорд, като се използва BioRad протеинов анализ (BioRad, Мюнхен) и BSA калибрираща линия (0,7 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0, 1 mg/ml).

3. Материал и методи 28 3.2.7. Гел електрофоретичен анализ на протеини чрез SDS-PAGE използвани буфери (съгласно Lämmli 1970): 10 × SDS работещ буфер Tris 25 mm глицин 191 mm SDS 10% (w/v) отделящ гел буфер Tris, pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % Подреждане на гелен буфер Tris, ph 6.8 0.5 M SDS 0.4% 4 x SDS пробен буфер Tris, ph 6.8 250 mm глицерол 40% SDS 10% 2-меркаптоетанол 20% бромофенол синьо 1 mg Системата на прекъсната Използвана SDS-полиакриламидна гел електрофореза в модифицирана форма съгласно Lämmli 1970. Mini-Protean II (BioRad, Мюнхен) служи като апарат за електрофореза. Прилагат се 20 μg общ протеин на лизатите или супернатантата на имунопреципитатите, които преди това са били смесени с 4x SDS пробен буфер и денатурирани с топлина (5 минути, 95 ° С). Електрофорезата се провежда при постоянна сила на тока 20 ma в събиращия гел и 35 ma в отделящия гел.

3. Материали и методи 32 и киназната реакция се провежда с концентрация на АТР 10 mm при 37 ° С за един час. Всички следващи стъпки бяха обработени в съответствие с инструкциите. Абсорбцията се измерва при 405 nm (референтна дължина на вълната 620 nm). 3.2.12. Денситометрична оценка на имуноблоти За денситометричното сравнение на силата на лентата, експонираните рентгенови филми бяха сканирани с помощта на скенер за пропусната светлина (Sharp JX-330) и анализирани с 1D софтуера от Phoretix (New Castle upon Thyne, Великобритания). 3.2.13. Изолиране на РНК от ацини Стимулирането на изолирани ацини се спира с ледено студен РНК без PNAse, центрофугира се при 1000 rpm в продължение на 5 минути и супернатантата се изхвърля. РНК се изолира съгласно протокола Promega (SV Total RNA Isolation System, Promega, Mannheim). 3.2.14. Проверка на чистотата и качеството на определяне на концентрацията на РНК Изолираната РНК се разрежда 1: 100 с вода и абсорбцията се измерва при две различни дължини на вълните. Концентрацията на РНК се изчислява от абсорбцията при 260 nm и чистотата на изолираната РНК се получава от съотношението 260/280 nm. Изчисляване на концентрацията: абсорбция от 1 = 40 µg/ml

3. Материал и методи 34 леко смесени. Пробите се зареждат в гела и се разделят при 50 V за около 1-2 часа. 3.2.15. Хибридизация на генните масиви Прехибридизацията на филтрите 0,5% SDS се вари и мембраните (GF300 - GeneFilters Rat Microarrays Release 1, Res Gen, Invitrogen) се инкубират с този разтвор за 10 минути при стайна температура преди всяка прехибридизация. ДНК от сперма от 90 μl сьомга (ssdna) се вари 5 минути при 95 ° С и се охлажда за кратко върху лед. След това ssdna и 120 μl trna се добавят към 12 ml буфер за предхибридизация. Предхибридизацията се извършва в продължение на няколко часа при 42 ° С в хибридизационната пещ. Предхибридизационен буфер: формамид 50% SSC 6x Denhardt s 5x NaPO 4 50 mm SDS 0,5% реакция на обратна транскриптаза (RT) 25 μg от РНК се изпаряват във всеки случай върху 11 μl течност в Speed ​​Vac. За RT беше използван комплектът Ambion Strip-EZ ™ RT (Ambion, Austin, TX). 25 µg РНК/11 µl 2 Ml Oligo (dt) от Ambion, Тази смес се вари при 65 ° С в продължение на 5 минути и след това се охлажда до 42 ° С. Това беше последвано от добавянето на:

3. Материал и методи 35 2 μl 10x RT буфер 2 μl 10x dntp 1 μl MMLV RT (обратна транскриптаза) 2 μl (= 20 μci) P 33 -α datp (Amersham) RT се провежда при 37 ° С в продължение на 1 2 часа . Пречистване на cdna Първо беше извършено разграждане на RNAse H за отстраняване на RNA. За това към пробата се добавя 1 μl РНКаза Н и се инкубира при 37 ° С в продължение на 30 минути. Cdna се пречиства, като се използва комплект за отстраняване на нуклеотиди (Qiagen, Hilden). След пречистването пробата се елуира от колоните с 50 μl EDTA (50 mm). Състезание на повтарящите се cdna последователности Състезателен микс: 50 µl 20x SSC 70 µl 10 mm Tris ph 8,0 45 µl Плъх Hybloc (1 mg/ml) (Applied Genetics Laboratories, Мелбърн, Австралия) 20 µl 1% SDS Състезателният микс и пречистената cdna се денатурира отделно за 5 минути при 95 ° С и веднага се охлажда върху лед. След това и двете партиди се комбинират и се инкубират при 56 ° С в продължение на 40 минути. Конкурентната cdna се пипетира в нов разтвор за прехибридизация и се добавя към генните филтри. Хибридизацията се извършва най-малко 18 часа при 42 ° С в хибридизационната пещ.

3. Материали и методи 36 Измиване на филтрите Пробата се изхвърля и филтрите се измиват два пъти за 5 минути с 2 пъти SSC; 0,1% SDS се промива при RT. Това беше последвано от два по-строги етапа на измиване при 68 ° С с 0.2 × SSC; 0,1% SDS за 15 минути всеки. Генните масиви бяха поставени между 2 слоя филтърна хартия, за да се отстрани останалата течност и увити във фолио. Фосфорен екран (Kodak, Щутгарт) се прилага за около 5 дни. Сигналът е сканиран с помощта на фосфорен скенер (Molecular Dynamics, Amersham Biosciences, Сънивил, Калифорния) и е оценен със софтуера Array Vision 6.0 (Imaging Research).

4. Резултати 37 4. РЕЗУЛТАТИ 4.1. РЕГУЛИРАНЕ НА НИВО НА ПРОТЕИНИ 4.1.1. Експресия на протеин на Src киназите За да се изследва моделът на експресия на протеин на Src киназите в ацинарни панкреатични клетки на плъхове, 20 μg от общия протеин се извлича от изолирани ацини на панкреаса на плъха и се отделя чрез електрофореза. Протеинът се прехвърля в PVDF мембраната в Western blot и се изследва за експресията на повсеместно експресирани кинази от семейство Src. Използвани са антитела срещу киназите Да, Src, Lyn и Fyn. Да и Lyn се експресират в ацинарните панкреатични клетки на плъха WAG, докато Src и Fyn не могат да бъдат открити (фиг. 5). За киназата Src използваме контрола (клетъчен лизат от клетъчна линия A431), тъй като Src е описан в ацинарните клетки в литературата (Nozu et al. 1999). Въпреки това, Src киназата не може да бъде открита при нашите плъхове. IB: Да Lyn Fyn Src 1 2 3 4 5 Фиг. 5: Експресия на кинази от семейство Src в ацинарните клетки на плъха WAG. Линии 1 до 4: общ протеин; Линия 5: положителен контрол за Src (клетъчен лизат от A431).