Приготвяне на проби от ларви на дрозофила за газова хроматография-масова спектрометрия (GC-MS)

Обобщение

Този протокол описва как да се подготвят ларви на дрозофила за метаболомен анализ, базиран на GC-MS.

Резюме

Въведение

Drosophila Drosophila melanogaster се появи като идеална система за изучаване на молекулярните механизми, които регулират междинния метаболизъм. Не само че повечето метаболитни пътища са запазени между дрозофила и хората, но основните сензори за хранителни вещества и регулатори на растежа, като инсулин, Tor и myc, също са активни в движение 1, 2. В резултат на това дрозофила може да се използва за изследване на метаболитната основа на заболявания, вариращи от диабет и затлъстяване до невродегенерация и рак. В това отношение развитието на ларвите на дрозофила осигурява идеалната среда за изучаване на метаболитна програма, наречена аеробна гликолиза, или ефектът на Варбург. Подобно на много тумори използват аеробна гликолиза, за да генерират биомаса от въглехидрати, следователно, за да накарат ларвите на Drosophila да активират аеробна гликолиза, за да стимулират растежа на развитието 3, 4, 5. Тези прилики между ларвите и туморния метаболизъм установяват дрозофилата като ключов модел за разбиране как аеробната гликолиза се регулира in vivo.

Въпреки факта, че мухата се е утвърдила като популярен модел за изучаване на метаболизма, повечето изследвания на дрозофила разчитат на методи, предназначени да измерват 3 различни метаболита, като трехалоза, триглицериди или АТФ. Тъй като е необходим специфичен протокол за измерване на всеки метаболит, аналитичните изследвания са досадни, скъпи и пристрастни в полза на онези съединения, които могат да бъдат измерени с помощта на търговски комплекти. Решение на тези ограничения се появи в областта на метаболомиката, която осигурява по-ефективно и безпристрастно средство за изследване на метаболизма на дрозофила. За разлика от аналитично изследване, един метаболомичен анализ може едновременно да измерва стотици метаболити на малки молекули и да осигури цялостно разбиране за метаболитното състояние на тялото 6, 7. Тази техника значително разшири обхвата на метаболитните изследвания на дрозофила и представлява бъдещето на това ново поле 8 .

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Събиране на яйца

2. събиране на пробата от ларвите

Възраст на ларвите до желания етап. Ако събирате L3 ларви, ресинхронизирайте пробите до L2 - L3 линията. Ресинхронизацията обикновено се извършва с помощта на метод, описан по-рано, който използва предните стигмати като важна стъпка от развитието 15. Като алтернатива, ларвите на mi-L3 могат да бъдат синхронизирани с помощта на sgs3 16 репортерен ген .
Забележка: В това отношение откриваме ларви на mi-L2 (

30 сек. През това време ларвите ще потънат на дъното на тръбата, но маята ще остане в суспензия. След като всички ларви образуват хлабава гранула, отстранете разтвора на NaCl с помощта на 1 ml пипета.

Повторете стъпки 2.4 и 2.5 два пъти, или докато окончателният разтвор за измиване стане бистър.
Забележка: Може да не е необходимо допълнително измиване, ако пробата съдържа прекомерно количество мая.

Проби за центрофугиране при 2000 × g за 1 мин при 4 ° C.

Отстранете всички остатъчни разтвори с помощта на 200 µL пипета.

Веднага замразете пробата в течен азот.
Забележка: Протоколът може да бъде поставен на пауза на тази стъпка. Пробите могат да се съхраняват до 3 месеца при -80 ° C.

3. Прехвърлете пробите в Bead Tubes

4. Извличане на пробата

5. химична дериватизация

6. Откриване на GC-MS

Забележка: В повечето случаи потребителят ще извърши тази стъпка с помощта на централна лаборатория за масова спектроскопия. Този протокол е предназначен за използване с 30m, GC колона с 5m предпазна колона.

1. Рандомизирайте реда на пробата.
2. Пригответе GC-MS.
   1. Регулирайте дебита на хелиевия носещ газ на 1 mL/min.
   2. Задайте температурата на входа на 250 ° C.
   3. Програма на GC да изпълнява следния температурен градиент:
      1. Първоначална температура при 95 ° C, със задържане от 1 min.
      2. Увеличете температурата до 110 ° C със скорост 40 ° C/min с 2 минути задържане.
      3. Увеличете до 250 ° C при рампа от 5 ° C/min.
      4. Увеличете до 330 ° C при 25 ° C/min с крайно задържане от 4 минути.

      ---