Полувисокопроизводителен метод за изображения и инструментариум за визуализация на данни за анализ C

Обобщение

Тази работа описва полупроизводителен протокол, който позволява едновременно 3D изобразяване на времеви интервал на ембриогенеза при 80–100 С. зародиши на elegans за едно нощно бягане. Инструментите за обработка на изображения и визуализация също са включени за оптимизиране на анализа на данните. Комбинацията от тези методи с персонализирани репортерски щамове позволява подробно проследяване на ембриогенезата.

Резюме

Въведение

Ембрионът на C. elegans е важна моделна система за механистична клетъчна биология и анализ на спецификацията на клетъчната съдба и морфогенетични събития, които движат ембрионалното развитие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. Към днешна дата голяма част от характеризирането на двете събития на клетъчно ниво и спецификациите на съдбата на клетките в ембриона е постигнато с експерименти с относително висока времева разделителна способност, използващи флуоресцентни маркери. Въпреки че този подход работи добре за събития от порядъка на секунди до десет минути, той става технически ограничен за характеризиране на по-дълги процеси от часове до дни. Ембрионалното развитие от първото разцепване до края на разтягането отнема около 10 часа. В този времеви мащаб методите на полупропускливост, които биха позволили едновременно изобразяване с по-ниска разделителна способност във времето (т.е. придобиване на интервали от 5 до 20 минути) на по-големи кохорти от ембриони от различни условия, биха отворили нов набор от експерименти; z. Б. позволяване на систематични мащабни скринингови усилия и анализ на достатъчен брой ембриони за сравнение на последиците от молекулярните нарушения.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Подгответе ембрионите на C. elegans за изображения с висока производителност

ЗАБЕЛЕЖКА: Целта на тази част от протокола е да се създаде популация от полусинхронизирани (2 до 8 клетъчен стадий) C. elegans ембриони, които се дисектират от подходящи маркерни щамове (Фигура 2) в стъклена дънна 384-ямкова плоча за изобразяване. Други формати на плочи също биха могли да работят, но 384 плочки с ямки са за предпочитане, тъй като малкият размер на кладенеца ограничава разпространението на ембриона на относително малка площ, което улеснява идентифицирането на полета, съдържащи множество ембриони, за заснемане във времето. Приблизителната синхронизация на ембрионите гарантира, че целият процес на развитие на всеки от ембрионите в дадено поле се записва.

2. Точкуване на ембрионална леталност

  1. Въз основа на сканираните полета, ембрионалната леталност и дефектите на ларвите се оценяват чрез преброяване на излюпени червеи и неизлюпени ембриони за всяка ямка.
  2. Постигнете неизлюпени ембриони като ембрионална фаталност. Изключването на арестуваните едно- до четириклетъчни ембриони от оценката на фаталността, тъй като младите разрязани ембриони понякога не успяват да завършат образуването на яйчена черупка (когато мейозата II все още не е завършена) и дефектите на пропускливостта могат да доведат до осмотични усложнения през първите две години. Бизнес области.
  3. Оценете частично излюпени или напълно излюпени червеи с морфология на тялото или поведенчески разстройства, като мръсна или парализирана, като "необичайна ларва".

3. Автоматизирано подрязване (Фигура 3А.)

ЗАБЕЛЕЖКА: Софтуерът се помещава на две места: (1) Зенодо съхранява лесна за ползване версия на софтуера 12, която не изисква никакви познания по програмиране. (2) Github съдържа изходния код за нашия embryoCropUI.py и screenCrop.py софтуер 13, които изискват знания за Python. Подробни инструкции за изтегляне и работа с двете версии на програмата са дадени по-долу.

4. Визуализация (Фигура 4)

ЗАБЕЛЕЖКА: OpenandCombine_embsV2.ijm 10, 12 е макрос ImageJ, който създава лесно разпознаваем тиф файл от всички изображения за дадено разтягане и състояние. Изисква се инсталиране на FIJI/ImageJ 14, 15. Този макрос се изпълнява според нашата файлова структура. Трябва да се промени, за да работи с различни файлови структури. Инструкции за правилната файлова структура и подробно описание на важни съображения можете да намерите в края на GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx файл в хранилището на Zenodo. Моля, прочетете изцяло тези инструкции, преди да прегледате правилно изобразяването на имена и структурирането на файлове, за да получите най-добрия интерфейс с този макрос. За справка, нашата структура за местоположение на файла изглежда така:
Z: -потребителски, Target'Strain'Emb'Target_Emb'_15 цифров уникален идентификатор _W '# F_T' #_ Z '#_ C'.tif
напр. Z: -кропиран-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Основно предизвикателство при характеризирането на ефекта на молекулярните нарушения върху ембрионалното развитие на C. elegans е, че отнема приблизително 10 часа, докато ембрионите прогресират от първото разцепване до края на разтягането при 20 ° 16. Подходът с половин пропускателна способност, който позволява едновременното изобразяване на големи кохорти от ембриони, е полезен за събития в този времеви мащаб, тъй като позволява да се картографират множество условия успоредно с достатъчен размер на ансамбъла за всяко условие, за да се позволи количествен анализ (Фигура 1А.).

полувисокопроизводителен
Фигура 2. Персонализирани щамове, генерирани за изобразяване с висока разделителна способност на C. elegans ембриогенезатабяха. (А.) Схемите илюстрират трансгените, използвани за конструиране на щамове на зародишния слой (отгоре) и морфогенеза (отдолу). (Б.) Проекционните повърхности с максимална интензивност показват хода на развитието в морфогенезата на щамовете (отгоре) и зародишния слой (отдолу). Вентрален изглед е показан, както е показано на електрическите схеми (вляво). Времето е относително към десетичната запетая (t = 0), което е лесно разпознаваемо и в двете стъбла. Мащабна лента = 10 m. Фигура с любезното съдействие на Wang et al. 10 възпроизведени. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

метод
Фигура 3. Персонализираната програма за изрязване изолира и ориентира отделни ембриони от образни полета. (А.) Схемата илюстрира функционалността на персонализираната програма за изрязване на ембриони и подчертава двете опции за достъп до тази програма: удобен за потребителя GUI интерфейс, който не изисква познания по програмиране и се основава на Zenodo (вляво) и версия на програмата за партидно изрязване, Python Изисква опит и е достъпен на Github (вдясно). (Б.) Графиката обобщава автоматизирания алгоритъм за изрязване - генерира се двоична маска от 8-битови изображения с ярко поле и отделните ембриони се разпознават, изрязват и подравняват по предната задна ос. Мащабната лента е 10 m. (° С.) Схема описва процеса, използван за итеративно разпознаване на ембриони в бинарната маска. (Д.) Схематично илюстрира метода за ориентиране на ембриони по предната и задната ос. Панели B-D възпроизведени с разрешение от Wang et al. 10. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

метод
Фигура 4. Персонализираният макрос ImageJ позволява да се визуализират данни за скрининг на RNAi чрез генериране на съставни файлове за всяко условие. (А.) Показани са ембриони за три примерни RNAi състояния от тестовия набор от 40 гена (вж. Wang et al. 10, 11 за пълния набор от данни) (вдясно), подчертавайки различните подписи фенотипове, които са общи за всеки и възпроизводимостта фенотипите във всяко състояние. Панелът е направен с разрешение от Wang et al. 10 адаптирани. (Б.) Контролният панел илюстрира как персонализираният макрос ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm) изгражда ембриони от конкретно състояние на RNAi в композитен файл ImageJ, който настройва яркото поле и прогнозите за максимален интензитет за всеки ембрион във всеки момент от времето. Въпреки че е подчертан само един пример, този макрос може да компилира данните за много RNAi условия едновременно. Макросът ImageJ се предлага на Zenodo 12. Мащабна лента = 10 m. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Заедно методът с полу-висока производителност на филма, заедно с инструментите за изрязване на ембриони и обработка на изображения, описани тук, ще улесни анализа на ембрионалното развитие на C. elegans с различни мутанти, разстройства и маркерни щамове. В момента в нашата собствена лаборатория се провежда мащабен екран, използващ тези методи за заснемане на ембриони от двата поръчкови щама, описани тук, след като са необходими 2000 гена, за да се развият. В крайна сметка данните от тези усилия ще служат като друг ресурс за засилване на усилията за разбиране на спецификацията на клетъчната съдба и морфогенетичните събития по време на ембриогенезата.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.