Поява и откриване на цитринин в храни от растителен произход - PDF безплатно
От научния център на Weihenstephan за хранене, земеползване и околна среда на Техническия университет в Мюнхен, катедра по хигиена на животните Унив. - проф. Д-р Д-р h.c. Йохан Бауер Изпратено от Института по хигиена и технология на храните от животински произход Катедра по хигиена и технологии на млякото Унив. - проф. Д-р Erwin Märtlbauer Ветеринарен факултет на Университета Лудвиг Максимилианс Мюнхен Поява и откриване на цитринин в храни от растителен произход Встъпителна дисертация за получаване на ветеринарна докторска степен на ветеринарния факултет на Университета Лудвиг Максимилианс Мюнхен от Клаудия Барбара Шнайдер от Мюнхен Мюнхен 2007
Отпечатано с разрешение на Ветеринарния факултет на Университета „Лудвиг Максимилианс” в Мюнхен Декан: Лектор: Съ-рефер: Унив.-проф. Д-р E. P. Märtlbauer проф. Д-р Märtlbauer юни проф. Д-р Ден на дипломирането на Deeg: 9 февруари 2007 г.
Съпругът ми и двете ми дъщери
Страница I Съдържание Въведение. 1 Б литература. 3 1 Физични и химични свойства на цитринин. 3 2 Гъби, произвеждащи цитринин. 5 3 Поява на цитринин. 7 4 Токсикокинетика. 9 5 Биологични свойства на цитринин. 10 5.1 Ефекти върху микроорганизмите. 10 5.2 Ефекти върху макроорганизмите и клетъчните системи. 10 5.2.1 Цитотоксичност. 11 5.2.2 Нефротоксичност. 12 5.2.3 Генотоксичност. 15 5.2.4 Канцерогенност. 16 5.2.5 Ембриотоксични и тератогенни ефекти. 17 5.2.6 Комбинирани ефекти с други микотоксини. 17 5.3 Фармакологични свойства. 18 6 Метод за откриване на цитринин. 19 C Материал и методи. 20 1 материал. 20 1.1 Примерен материал. 20 1.2 Консумативи. 21 1.3 Консумативи. 21 1.4 Химикали. 22 2 метода. 22 2.1 Разработване на метод за определяне на цитринин в зърнени култури. 2.1.1 Предварителни тестове за екстракция. 2.1.2 Предварителни тестове за пречистване. 24 2.1.2.1 Разделяне течност-течност. 24 2.1.2.2 Пречистване чрез екстракция с твърда фаза. 30 2.1.2.3 Пречистване чрез имуноафинитетна хроматография. 33 2.2 Разработване на методи за определяне на цитринин в плодови и зеленчукови сокове. 34
Page II 2.3 Ориентационни проучвания за стабилността на цитринин в плодови сокове 38 2.4 Определяне на цитринин в азиатските храни. 38 2.5 Валидиране на методите. 39 2.6 Масспектрометрично определяне на цитринин. 41 2.6.1 LC-MS анализ на зърнените култури. 41 2.6.2 LC-MS/MS анализ на плодови и зеленчукови сокове, както и на азиатски храни. 42 2.7 Изследване на търговските проби. 43 D резултати. 45 1 Откриване и определяне на цитринин с помощта на ESI-MS или MS/MS. 45 2 предварителни експеримента за определяне на цитринин в органични матрици. 48 2.1 Зърнени храни. 48 2.1.1 Извличане. 48 2.1.2 Пречистване. 49 2.1.2.1 Разделяне течност-течност. 49 2.1.2.2 Пречистване чрез екстракция в твърда фаза. 52 2.1.2.3 Пречистване с помощта на имуноафинитетни колони. 54 2.2 Плодови и зеленчукови сокове. 55 2.2.1 Резултати от предварителните тестове. 55 2.2.2 Предварителни проучвания за стабилността на цитринин в ябълков сок. 57 2.3 Валидиране на метода. 58 3 Поява на цитринин в храната. 61 3.1 Зърнени култури. 61 3.2 Плодови и зеленчукови сокове. 62 3.3 Азиатски храни. 62 Е дискусия. 63 F резюме. 68 G Резюме. 69 Н Библиография. 70
Страница III Списък на фигури: Фигура 1: Структурна формула на цитринин, A) p-хинонова форма и B) o-хинонова форма . 3 Фигура 2: LC-MS хроматограми (m/z 251) на стандартен разтвор (5 ng/ml, по-горе) и проба от царевично брашно, съдържаща цитринин (4,4 µg/kg, по-долу). 46 Фигура 3: Масов спектър на цитринин (ESI +, конусно напрежение 30 V). 46 Фигура 4: LC-MS/MS хроматограми (m/z 249/175) на стандартен разтвор (1 ng/ml, по-горе) и проба от ябълков сок, изкуствено замърсена с цитринин (c: 0,1 ng/ml, по-долу). 47 Фигура 5: Поведение на разграждане на цитринин в ябълков сок при стайна температура. 58
Страница VI Списък на съкращенията aw стойност активност на водата БЕН Балканска ендемична нефропатия BHK21 клетки Babyhamster бъбречни клетки CHO-K1 клетки ДНК на китайски хамстер яйчници ДНК Дезоксирибонуклеинова киселина (DNS: Деоксарибонуклеинова киселина) EIA Ензимен имуноанализ (ензимен имуноанализ) g ускорение поради гравитацията (1g = 9,81 m 2) g грама HCl солна киселина Hela клетки Човешки маточни клетки карциномни клетки HEK293 клетки Човешки ембрионални бъбречни клетки HL-60 клетки Човешки промиелоцитни левкемични клетки HPLC Високоефективна течна хроматография HPRT Хипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансфераза HTC-клетки Хепатома тъканни клетки IAC Immunoa Imuna Immunoa IARC Международна агенция за изследване на рака im интрамускулно i.p. интраперитонеално i.v. интравенозно kg килограми телесно тегло LC-MS течна хроматография-масспектрометрия LC-MS/MS течна хроматография-тандемна масспектрометрия LD letaldose LLC-PK1 Свински бъбречни клетъчни клетки MDBK клетки Madin Darby говежди бъбречни клетки MeOH метанол мин минути милилитри mm милимолари MPN Микотоксична свиня нефропатия m-rns пратеник рибонуклеинова киселина m/z маса/заряд n брой NADH никотинамид аденин динуклеотид N 2 азот nm наномоларен ng нанограм nn неоткриваем PBS фосфатно-буфериран физиологичен разтвор p.o. per os
Страница VII ppb части на милиард ppm части на милион RNS рибонуклеинова киселина r-rns рибозомна рибонуклеинова киселина RP Обратно-фазова RNS рибонуклеинова киселина s.c. подкожен анализ на SCE сестра анализ на хроматиден обмен TBME третичен бутил метил етер TLC тънкослойна хроматография UDS анализ непланиран синтез на ДНК (синтез на възстановяване на ДНК) анализ V79 клетки белодробни фибробласти на мъжки китайски хамстери СЗО Световна здравна организация µg микрограма µm микромоларен
Литература страница 6 Таблица 2: Род Aspergillus Penicilium Monascus, произвеждащи цитринин гъби (Cole and Cox, 1981; Betina, 1989, Roth et al., 1990; Frank, 1992; Blanc et al., 1995b, Wang et al., 2005) Видове A. candidus A. flavipes A. niveus A. terreus P. canescens P. citroviridae P. citrinum P. claviforme P. expansum P. fellutanum P. implicatum P. janthinellum P. jenseni P. lividum P. palitans P. purpurrescens P. . roqueforti P. spinolosum P. velutinum P. verrucosum M. floridanus M. lunisporas M. pallens M. pilosus M. purpureus M. ruber M. sangiuneus
Литература стр. 19 6 Методи за откриване на цитринин В сравнение с други микотоксини има само малко данни за появата на цитринин в храната. Това отчасти се дължи на неговите аналитични особености, при което нестабилността на токсина по време на приготвянето на пробата и произтичащите от това колебания в степента на възстановяване (Wilson, 1994), както и изразеното замърсяване по време на хроматографското откриване могат да се окажат проблематични (Dick, 1988). Към днешна дата откриването на цитринин се извършва главно с помощта на тънкослойна хроматография (TLC) (Blanc et al., 1995a, b, Martins et al., 2002, Gimeno, 1984), високоефективна течна хроматография (HPLC) с UV (Phillips et al., 1980) или флуоресцентна детекция ( Lepom, 1986, Reinhard & Zimmerli, 1999b, Schneweis et al., 2001) и газова хроматография (GC) (Shu & Lin, 2002). и се използват ензимни имуноанализи (EIA) (Abramson et al., 1996, 1999, Dietrich et al., 1998, 1999, Vrabcheva et al., 2000, Schmid, 2002).
Материал и методи стр. 20 C Материал и методи 1 Материал 1.1 Примерен материал В тази работа се изследваха предимно зърно и зърнени продукти, както и плодови и зеленчукови сокове. Освен това бяха анализирани отделни азиатски храни. Пробите са получени от търговци на хранителни стоки. Зърнени култури Общо 380 проби бяха анализирани за наличие на цитринин. От тях 279 са зърнени/зърнени продукти и 69 са царевица/зърнени продукти. Освен това бяха изследвани 19 продукта от елда/елда и 13 проби от ориз. Плодови и зеленчукови сокове От 98 анализирани сока 34 са ябълка, 27 портокал, 7 грозде, 8 ананас, 4 круши, 7 банани, 3 праскови, 4 мултивитамини, 3 домати и 1 мандарина. Азиатска храна Изследвани са 2 проби вино саке и 2 соса хой-син, както и азиатска паста за подправки за наличие на цитринин. За разработване и утвърждаване на методите за откриване е използван микологично безвреден материал за проби. Изкуственото замърсяване на материала на пробата се извършва със стандартни разтвори на цитринин.