Подготовка и използване на прясно изолирани човешки детрузорни гладкомускулни клетки за
Обобщение
Ние описваме метод за получаване на прясно изолирани гладки клетки от детрузор от проби от човешки резервоар за урина, използвайки двуетапна ензимна процедура. Получените жизнеспособни DSM клетки могат да бъдат изследвани чрез различни едноклетъчни техники, включително електрофизиология на амфотерицин-В пластирната скоба, описана за разкриване на физиологични и фармакологични свойства.
Резюме
Въведение
В края на 80-те и началото на 90-те години групата Isenberg (Германия) публикува поредица от електрофизиологични проучвания върху прясно изолирани DSM клетки, получени от пикочните мехури на морски свинчета 9, 10, 11, 12, 13 (таблица1). Методът подчерта две важни наблюдения, които спомогнаха за осигуряването на жизненоважни клетки и послужиха като първоначална насока за другите да следват. Те бяха 1) предварителна обработка на изолираните парчета DSM с разтвор без Са2/среда преди ензимно третиране и 2) смилане на тъкан с разтвор, съдържащ колаген. Тези две критични стъпки бяха включени във всички следващи варианти на процедурите за дисоциация на DSM клетките (маса 1). В момента нашата група използва последователен двуетапен подход на дисоциация на папаин-колагеназата. Парчетата DSM първо се обработват с ензимен разтвор, съдържащ папаин, след това с колаген тип II, разтворен в същия разтвор (DS, разтвор за дисекция/смилане). Този подход дава уникални DSM клетки от различни видове, включително морско свинче, прасе, плъх, мишка и особено човек (маса 1).
Взети заедно, методът, описан тук, за получаване на единични DSM клетки, прясно изолирани от пикочния мехур на човека, осигурява жизнеспособни клетки, много подходящи за електрофизиологични изследвания, използвайки различни конфигурации на техника за закрепване на пластира, Ca 2 -изображение, имуноцитохимия, анализ. едноклетъчна RT-PCR/qRT-PCR, както и усъвършенствани техники за молекулярна биология, включително анализ на микрочипове, RNA-seq и CHIP-seq. Използването на метода на перфорираната скоба за амфотерицин-В запазва естествената клетъчна среда за разлика от други конфигурации. Когато се изпълняват, като се използват специфичните условия, описани тук, предназначени да анулират входовете на K и Ca 2 токове в DSM клетки, индуцираните от напрежение токове показват свойствата на неселективни катионни токове, подходящи за биофизични характеристики и фармакологични.
Протокол
Всички методи, описани тук, са одобрени от комитетите на Институционалния съвет за преглед на Центъра за здравни науки към Университета в Тенеси (Мемфис, Тенеси, IRBMD 17-05714-XP) и Медицинския университет в Южна Каролина (Чарлстън, Южна Каролина). IRBMD 00045232). Одобрените процедури позволяват вземането на проби от пикочен мехур с цялата дебелина (с „1 cm на“ 1 cm) - съдържащи всички слоеве, включително лигавицата, гладката мускулатура на детрузора и серозата, прикрепени към кръвоносните съдове и мастната тъкан) - да бъдат взети от пациента -донори, подложени на хирургично частично отстраняване на пикочния мехур. Пациентите донори са възрастни (изследвана досега възрастова група: 25 до 87 години), мъже или жени, със или без симптоми на свръхактивен пикочен мехур (класифициран от I-PSS резултат на Американската урологична асоциация 41). Хирургичните процедури включват различни медицински състояния, включително радикална цистектомия за уротелиален карцином и аденокарцином. В такива случаи събраният пробен резервоар за урина се отстранява от мястото на тумора.
1. Дисекция на DSM тъкан и подготовка на DSM парчета без лигавица
2. Ензимна дисоциация на парчета DSM, давайки прясно изолирани единични клетки на DSM
3. Записване на катионните токове, индуцирани от напрежението на DSM клетките, като се използва цялата техника за корекция на напрежението на клетката, перфорирана от амфотерицин-В
4. Анализ на данни и визуализация