Откриване на протеинови взаимодействия и характеризиране на протеиновата функция с помощта на технологията HaloTag

Обобщение

Технологията HaloTag е многофункционална технология, която е показала значителен успех при изолирането на малки и големи протеинови комплекси от клетки на бозайници. Тук ние подчертаваме предимствата на тази технология в сравнение със съществуващите алтернативи и показваме нейната полезност за изучаване на множество аспекти на протеиновата функция в еукариотните клетки.

Резюме

Въведение

Разбирането на клетъчната функция, реакцията на стимули и промените в състоянията на развитие и/или заболяване е тясно свързано с разгъването на протеома в тези различни динамични състояния 1,2. Направено е много за разбирането на протеома на по-нисшите организми, но предвид броя на протеините и всички възможни взаимодействия, това стана много предизвикателно при справянето с човешки протеоми 1, 3–7. Напредъкът в масовата спектрометрия значително даде възможност за провеждане на тези изследвания и тук представяме допълнителен и значителен напредък в развитието на технологията HaloTag както за ефективно откриване на протеинови комплекси, така и за функционална характеристика на човешките протеини от клетки на бозайници 8-10. Тази технология наскоро беше доказана в няколко проучвания, че е критичен фактор за откриването на важни взаимодействия, което позволява прозрение за новата белтъчна функция и разбиране на заболяването 11-13.

Тук представяме изтеглящи и образни протоколи, приложени към два ключови терапевтични протеина, протеина бромодомен BRD4 и хистонова деацетилаза, HDAC1 17. С тези примери показахме взаимодействието с партньори, както се очаква чрез масспектрометрия, ензимна активност след сложна изолация за HDAC1 и правилна клетъчна локализация и за двамата. Заедно тези резултати демонстрират многофункционалната същност и сила на техниката за характеризиране на еукариотните протеинови взаимодействия и функции.

Протокол

Забележка: Следният протокол може да се използва с всеки HaloTag Fusion и във всяка избрана клетъчна линия, стабилно или временно трансфектирана. За тези примери ние предоставяме протоколи за преходната трансфекция на сливанията на HaloTag в клетки HEK293T или HeLa. За всички експерименти препоръчваме да използвате само контролния протеин.

1. Тест за експресия на синтезиран протеин

3. Клетъчно изобразяване на флуоресцентно маркирани синтетични протеини с помощта на цитоплазмен и ядрено пропусклив лиганд

  1. Трансфекция, обозначаване и изображения на клетки:
    1. В 8-ямкови камерни покривни стъкла за всеки слят протеин или контрола, поставете 400 μl HeLa клетки във подходящата среда във всяка ямка при плътност 1-2 х 105 клетки/ml.
    2. Инкубирайте 18-24 часа при 37 ° C и 5% CO 2, след което трансфектирайте, както се препоръчва.
    3. 18-24 часа след трансфекцията, разредете TMR Ligand 1: 200 в подходяща клетъчна среда, след това добавете 100 μl от този разтвор във всяка ямка и разбъркайте внимателно.
    4. Инкубирайте трансфектираните клетки, съдържащи лиганди, за 15 минути при 37 ° С и 5% CO 2.
    5. Аспирирайте лигандите от средата и ги заменете с 500 μl подходяща среда, съдържаща липсващи протеинови сливащи лиганди, които са затоплени до 37 ° C
    6. Повторете два пъти за общо три измивания.
    7. Поставете клетките обратно в инкубатор (376, С и 5% CO 2) за 30 минути.
    8. Аспирирайте среда и заменете с 500 μl подходяща среда, която е загрята до 37 ° C
    9. Изображение на микроскоп с подходящи параметри на придобиване (TMR възбуждане: 555 nm, излъчване: 585 nm).

Представителни резултати

Когато работите с всеки нов синтетичен протеин, важно е първо да се тества експресията на протеина след трансфекцията и също така да се потвърди, че се произвежда протеин с правилното молекулно тегло. Тъй като сливните протеини на HaloTag могат да бъдат флуоресцентно и ковалентно маркирани с пропускливи или, в зависимост от локализацията, непропускливи лиганди, е възможно бързо да се определи експресията чрез денатуриране на клетъчни лизати чрез гел електрофореза, последвано от сканиране на флуоримаджър. Използвайки раздела 1.2, разпечатайте Halo BRD4 (189 kD) и само контролния HaloTag (Ctrl), наблюдаван (34 kD, 2А) описан протокол. Както е споменато в протокола, експресията на слети протеини може да бъде открита и с конвенционални Western blots с анти-HaloTag антитела, или ако те присъстват, антитела към протеина на стръвта. Ако е възможно, се препоръчва вместо това да се използва флуоресцентния лиганд, тъй като той е по-прецизен, по-бърз и по-лесен от откриването на антитела и също така количествен 10.

Изолирани комплекси също могат да бъдат изследвани за активност; Препоръчва се комплектите да се елуират с TEV протеаза (протокол раздел 2.5), така че да запазят функционалността си. В Фигура 3А е показано сребърно оцветяване на гел Halo-HDAC1 изтеглящи комплекси, освободени от смолата, използвайки TEV протеаза. Като TEV протеаза, значителни количества от протеина на стръвта, в случая HDAC1, се наблюдават в свързваща област между слетия протеин Tag и неговия сливен партньор (Фиг. 3А) да се разцепи. За да се определи дали тази фракция HDAC1 активност, елуирани TEV проби бяха тествани в HDAC-Glo 21 луминисцентен HDAC анализ. Както в 3В Както е показано, изтеглящите HDAC1 проби показват висока активност HDAC1 (колона 1), която е специфично инхибирана с известен HDAC инхибитор, SAHA 22 (колона 2). Като контроли за допълнителна демонстрация на специфичност, не се наблюдава инхибиране на HDAC със свързан фамилен инхибитор на сиртуин, EX-527 22 (колона 3) и не се открива сигнал само с буфер, даден без сондата за изтегляне HDAC1 (колона 4).

Съществена част от функционалната протеомика и разбирането на комплекси е също разбирането на локализацията на протеини и/или трафика на хора. Тъй като същите тези синтезни конструкции могат да бъдат флуоресцентно маркирани в клетките, ние наблюдавахме тяхната локализация, използвайки конфокално изображение. Следвайки протокола в раздел 3, HeLa клетките станаха преходни с Halo-BRD4 (4А) и Halo-HDAC1 (4B) трансфектиран флуоресцентно белязан с TMR лиганда и изобразен. Както в 4А и 4В показан локализиран както в ядрото, както се очаква 17. Тези данни показват, че присъствието на Tag не променя физиологичната клетъчна локализация на сливания партньор.

протеинови
Фигура 1. Схема на приложения за изтегляне на протеини и конфокални изображения. Използвайки го като конструкция на ингъл, са възможни няколко приложения за разбиране на белтъчната функция в клетките на бозайници. За всички, конструкция на халосно сливане е или стабилно, или преходно експресирана в прилепнали или суспензионни клетки на бозайници. За изтегляне на протеинови комплекси клетките се лизират, комплекси ковалентно се улавят върху смолата и се елуират чрез SDS елуиране (лява лента) или TEV разцепване (десен път). SDS елуирането се препоръчва, за да продължите с масспектрометричния анализ, докато TEV разграждането е оптимално за извършване на функционален анализ. За да се характеризира експресията, клетъчната локализация, събитията на трафик на хора или белтъчния оборот, живите клетки, слетите протеини са флуоресцентно маркирани и допълнително анализирани на SDS-PAGE гелове или чрез конфокално изобразяване. Налични са както клетъчни, така и непрозрачни флуоресцентни лиганди, в зависимост от местоположението или представянето на слетия протеин в клетката.

ild 2 "fo: content-width =" 6in "src ="/files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "width =" 600 "/>Фигура 2. Експресия на протеин на Halo-BRD4, анализ на изтегляне и масспектрометрия. (А) SDS-PAGE гел, показващ експресията на слят протеин на Halo-BRD4, 189 kD и само слят протеин на Halo-tag, 34 kD, контрол (Ctrl) в клетъчен лизат HEK293T с TMR лиганд (протокол, раздел 2.1). Геловете се сканират с флуоримаджър за откриване и се използва флуоресцентен маркер за молекулно тегло. (Б) Гелове за оцветяване със сребро, елуирани от биологични копия за изтегляния от проби Halo-BRD4 и Ctrl със SDS. Размери на молекулното тегло за гелевите спектрални числа (вляво) и нормализираните стойности на спектралния фактор на изобилие (NSAF) (вдясно), които отчитат молекулните тегла на протеините, идентифицирани в анализа на мас спектрометрията на биологични репликации Halo. (° С) BRD4 и Ctrl. Показани са протеини, за които е известно, че взаимодействат с BRD4, включително компоненти pTEFb (CDK9 и циклин Т) 18.20 и BRD9 19. В Ctrl не са идентифицирани пептиди от тези протеини.

откриване
Фигура 3. Изолиране на Halo-HDAC1 комплекс и анализ на активността. (А) Гелове за оцветяване със сребро, показващи изолирането на комплекси Halo-HDAC1 и фона от Ctrl след разцепване на TEV (раздел 2.5 на протокола). Маркират се видната HDAC1 лента (55 kDa) и TEV протеазната лента. Безплатният HDAC1 е оптимизиран чрез разцепване на TEV в линкер между сливането на HaloTag и HDAC1 след включване върху смолата (Илюстрация 1). (Б) Графиката показва активността на HDAC1 сложни изолационни проби в анализ на луминесцентна хистонова деацетилаза HDAC-генериран Glo 21. Колона 1 на графиката показва високи нива на HDAC активност с Halo-HDAC1 изтеглящи проби (HDAC1). Колона 2 показва, че тази активност може да бъде намалена специално чрез добавяне на HDAC инхибитор, SAHA 22, към падащите HDAC1 проби. Като контроли, колона 3 показва инхибитор на деацетилаза, специфичен за семейство сиртуин, но не инхибира HDACs, EX-527 22, не инхибира активността на HDAC1 и колона 4, не се наблюдава активност само с буфер.

протеинови
4. Halo-BRD4 и Halo-HDAC1 конфокално изображение. Конфокално изображение на живи клетки на HeLa клетки с Halo-BRD4 (А) или Halo-HDAC1 (Б) трансфектирани с TMR флуоресцентно маркирани лиганди. (А) Експресията на Halo-BRD4, ограничена до ядрото и (Б) Хало-HDAC1 изрази предимно ядрени. От лявата страна на панела на флуоресцентния канал и отдясно е наслагването на флуоресцентния канал с канала за всеки DIC. Изображенията са получени с помощта на конфокален микроскоп, оборудван с климатична камера с температура 37 ° C + CO 2 с подходящи филтри. Мащабна лента = 20 µm.

Дискусия

След като фузионните протеини са готови за изтеглящи експерименти, за да се постигне максимален успех с протокола, е много важно да се спазват препоръчаните времеви рамки в лизис, свързване и измиване на секции, тъй като едно от най-големите предимства е скоростта на сложната изолация Процес. Ако някоя от тези стъпки се удължи във времето, както се изисква за процедура на откриване на антитела, съществува риск от сложна дисоциация или повишено неспецифично свързване 8. По същия начин, ако времената по време на клетъчния лизис или свързване се съкратят клетките не са напълно лизирани или уловени ефективно или уловени. Ако броят на измиванията е намален или не се получи добро смесване на смолата при свързването или измиването, тогава фоновите нива на неспецифичните протеини се увеличават. В допълнение, средствата за лизис са много важни, тъй като се отнасят до афинитета на свързване към смолата. Опити за обработка с ултразвук, премахване на препоръчания почистващ агент, добавяне на SDS или други силни почистващи агенти и/или които протеазният инхибитор AEBSF ще намали или ще доведе до загуба на свързване на слетите протеини и техните комплекси със смолата.

Както беше споменато във въведението, значителен напредък в протеомиката се активира от значителен напредък в масовата спектрометрия 1,7. Следователно е важно да се подчертаят важни параметри при избора на анализ на масспектрометрията, за да се деконволюира сместа от протеини, получена при изтеглянията. Измервателните уреди трябва да са здрави и да могат да анализират редовно и ефективно проби, които съдържат малко количество протеин, често по-малко от 23,24. С технологията HaloTag може да се използва многофункционален подход, който насърчава проучванията на ProteomICs и получава по-добро разбиране на функцията на протеините в клетките на бозайници.

Разкриване

Разходите за публикуване на тази статия се спонсорират от Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy и Marjeta Urh са служители на Promega Corporation, собственици на търговски обекти чрез възлагане на патенти за технологията HaloTag и нейните приложения. Майкъл Форд, Ричард Джоунс, Рави Амунугама и Дейвид Алън са служители на MSBioworks, услугите за масова спектрометрия, описани в този ръкопис.

Благодарности

Благодарим на Dr. Мартин Розенберг, д-р Гари Тарпли и д-р. Кийт Ууд за подкрепата на тази работа и Dr. Джеймс Кали за критично четене на ръкописа. DLD, JM, HB, NM, AN, JC и MU са служители на Promega Corporation. MF, RJ, RA и DA са служители на MS Bioworks, LLC.