От медицинската клиника с фокус върху хематологията, онкологията и туморната имунология - PDF
От Медицинска клиника с фокус върху хематологията, онкологията и туморната имунология на Медицинския факултет Charité Universitätsmedizin Berlin ДИСЕРТАЦИЯ Индуцирано от онкоген стареене в последователността на колоректалния аденом-карцином и неговата функция като предиктор за отговора на 5-FU в първостепенно метастатична ситуация академична степен Doctor medicinae (д-р мед.), представена на Медицинския факултет Charité Universitätsmedizin Berlin от Anja Haugstetter от Щутгарт-Бад Канщат
Рецензент: 1. проф. Д-р мед. C. A. Schmitt 2. Проф. Д-р мед. Ф. Р. Гретен 3. Проф. Д-р мед. L. Zender Дата на докторат: 18 ноември 2011 г. 2
Съдържание 1 Въведение 6 1.1 Колоректален аденокарцином 6 1.1.1 Епидемиология на колоректалния аденокарцином 6 1.1.2 Рискови фактори за развитие на колоректален карцином 6 1.1.3 Прогностично значими фактори 7 1.1.4 Аденом карцином последователност 8 1.1.5 Онкоген ras 10 6 Терапия на колоректален аденокарцином 11 1.2 Апоптоза 11 1.3 Стареене 12 1.3.1 Характеристики на стареене 13 1.3.2 Потенциални маркери за стареене 15 1.3.3 Значение на индуцираното от онкоген стареене in vivo 18 1.3.4 Преждевременно стареене и химиотерапевтични средства 19 2 Изследователски въпрос 22 3 Материал и методи 23 3.1 Материал 23 3.1.1 Клетъчни линии и бактериална линия 23 3.1.2 Среда 23 3.1.3 Разтвори 24 3.1.4 Плазмиди 25 3.1.5 Устройства и аксесоари 25 3.1.6 Антитела 27 3
3.2 Методи 28 3.2.1 Клетъчна култура 29 3.2.1.1 Клетъчни линии 29 3.2.1.2 Субкултивиране на клетъчните линии 30 3.2.1.3 Криоконсервация на клетки 30 3.2.1.4 Брой клетки, криви на растеж, жизнеспособност 30 3.2.2 Ретровирусна инфекция 31 3.2.2.1 Използвани плазмиди 31 3.2. 2.1 Трансформация 31 3.2.2.2 Миниподготовка на ДНК 32 3.2.2.3 Максимална подготовка на ДНК 33 3.2.2.4 Фотометрично определяне на концентрацията на разтвора на ДНК 33 3.2.2.5 Електрофоретично разделяне на ДНК фрагменти 34 3.2.2.6 Трансдукция 34 3.2. 2.6.1 Трансфекция, медиирана от калциев фосфат 34 3.2.2.6.2 Инфекция на целевите клетки 35 3.2.3 Фиксиране и влагане на парафин на контролите 35 3.2.4 Методи за оцветяване 37 3.2.4.1 Имунохистохимия 37 3.2.4.2 Флуоресцентно оцветяване на SAHF 39 3.2.4.3 SA-бета-Гал - Оцветяване 39 3.2.4.4 Оценка на тъканното оцветяване 40 3.2.5 Поточни цитометрични измервания: BrdU-PI профил 40 3.2.6 Избор на пациенти и последващи данни 41 3.2.7 Анализ на мутация на K-ras 42 3.2.8 Статистика 42 4
4 Резултати 43 4.1 Производство на контроли за стареене от фибробласти 43 4.2 Стареене в криогенни тъкани 47 4.3 Стареене в парафинови тъкани 53 4.4 Оценка на клиничната значимост 65 5 Дискусия 73 5.1 Сравнение с текущата литература 74 5.2 Критични забележки 80 5.3 Прогноза 81 6 Резюме 83 7 Приложение 85 7.1 Библиография 85 7.2 Списък на фигури 95 7.3 Списък на таблици 96 7.4 Списък на съкращенията 97 7.5 Списък на публикациите 99 8 Благодарности 100 9 Автобиография 101 10 Подписка 103 5
Иницииране на увреждане на ДНК, на което клетката реагира със стареене, премалигненият тумор спира в растежа си. Тъканта може да се предпази от прогресия до злокачествен тумор. Фигура 5: Терапевтично предизвикано стареене. Роля на стареенето при прекалено злокачествени и злокачествени тумори. Активирането на онкоген в нормалните клетки води до първоначална хиперпролиферация. Полученото увреждане на ДНК активира програма за потискане на тумора, която спира развитието на премалигнения тумор. Откриват се типични черти на стареенето. Ако възникне мутация, която изключва програмата за супресор на тумора или, като алтернатива, ако има намаляване на придружаващите фактори, които насърчават стареенето, туморът започва да расте отново и се развива инвазивното злокачествено заболяване. Ако злокачественият тумор се лекува с химиотерапевтични средства, ако той реагира, той се води до апоптоза на клетъчното самоубийство или отново до стареене на крайния клетъчен цикъл. Какво точно се случва в молекулярната биология по време на прогресирането на недостатъчен тумор в карцином е неясно. От една страна, мутация на ефектора 20 би била възможна
Иницииране на сигналния път на стареещата машина, напр. мутация р53, с която премалигненият тумор започва да се размножава по неконтролиран инвазивен начин. Алтернативен модел вижда стареенето в премалигнената лезия като израз на онкогенна активност, заедно с други фактори, насърчаващи стареенето. Тези фактори могат да включват автономни клетки и евентуално локални неклетъчно автономни условия като напр. съдова плътност, наличие на хипоксия и цитокини, секретирани от макрофаги. След това прогресията в инвазивен карцином се обяснява с по-ниското просенесцентно налягане, което позволява преодоляване на OIS. Решаваща разлика в този модел е, че клетките остават генетично способни на стареене. В злокачествения тумор все още може да има няколко малки застаряващи области. Ако някой вече се лекува с химиотерапевтични средства, туморът може или да спре отново в стареене, или да премине в апоптоза, ако има отговор на терапията. 21-ви
Материал и методи 3 Материал и методи 3.1 Материал Лабораторните химикали са доставени от Merck (Германия), Biochrom (Германия), Sigma (Германия), Roth (Германия), Serva Electrophoresis (Германия), New England Biolabs (Германия), DAKO (Дания) и Gibco (САЩ) е с най-високо ниво на качество. Устройства и аксесоари, както и материали за клетъчни култури са получени от Falcon (Германия), Eppendorf (Германия), Nunc (Германия) и Techno Plastic Products (Швейцария) като стерилни изделия за еднократна употреба. Многократните материали бяха автоклавирани. Химикалите и материалите на други производители са показани в следващия списък. 3.1.1 Клетъчни линии и бактериална линия IMR90 American Type Culture Collection (ATCC), САЩ (CCl-186) прилепнали диплоидни човешки белодробни фибробласти от 16 седмичен плод Phoenix eco Nolan Lab, САЩ 135 прилепнали човешки ембрионални бъбречни клетъчни линии 293T E. coli (DH5α) Invitrogen, Германия 3.1.2 Среда на среда за култивиране на клетки (съхранявайте при 4 ° С) Модифицирана среда на орел на Dulbecco (DMEM + 4500 mg/l глюкоза + L-глутамин + пируват) + 10-15% FBS + 100 U/ml пеницилин-стрептомицин замразяваща среда ( съхранявайте при 4 C) FBS (фетален телешки серум) + 10% DMSO Лизогенен бульон (LB) среда 10 g/l триптон + 5 g/l NaCl, (евентуално + ампицилин) 23
Материал и методи 3.1.3 Разтвори PBS (буфериран с фосфат физиологичен разтвор) (съхранява се при стайна температура) 8 g NaCl (137 mm) + 0,2 g KCl (2,7 mm) + 1,44 g Na 2 HPO 4 (10 nm ) + 0,24 g KH 2 PO 4 (2 mm) напълнете до 800 ml с dh 2 O; титрува се до рН 7,4 до 1 l, напълва се с dh 2 O S1 разтвор (мини-препарат) (съхранява се при 4 ° С) 50 mm глюкоза + 25 mm Tris-HCl (ph 8,0) + 10 mm EDTA (ph 8, 0) в dh 2 O P1 разтвор (мини препарат) (съхранява се при 4 C) S1 разтвор + 100 µl/ml RNase A, добавете прясно във всеки случай разтвор S2 (мини препарат) (съхранявайте при стайна температура) 0,2 N NaOH + 1% SDS, т.е. 2 O, пригответе прясно всеки път разтвор на S3 (мини препарат) (съхранявайте при 4 ° С) 60 ml 5 M калиев ацетат + 11,5 ml оцетна киселина + 28,5 ml, т.е. 2 O 50 x TAE (съхранявайте при RT) 242 g Trisbase + 57,1 ml ледена оцетна киселина + 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) SA-бета-Gal-PBS (съхранявайте при RT) PBS + 1 mm MgCl 2 титрувано до рН 6 за човешка тъкан SA-бета-Гал-Фиксатор SA-бета-Гал-PBS + 2% параформалдехид + 0,25% глутаралдехид 24
Материал и методи X-Gal разтвор SA-beta-Gal-PBS + 1 mg/ml 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-ß-D-галактозид + 50 µl/ml 20 х разтвор на калиев цианид 20 х разтвор на калиев цианид (при 4 C) 820 mg K 3 Fe (CN) 6 + 1,050 g K 4 Fe (CN) 6 x 3h 2 0, напълнете до 25 ml с PBS Mowiol 4-88 (запазете аликвотни части при -20 C, предварително загрявайте до 37 C преди употреба ) Смесете 8 g Mowiol + 40 ml 0,2 M Tris-HCl (рН 8,5) при 50-60 ° С; След охлаждане: +20 ml глицерол + 2,5% DABCO QIAamp DNS Mini Kit Quiagen, Германия BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit 3130 Genetic Analyzer, Biosystems, USA 3.1.4 Plasmids Plasmid Backbone Insert Origin pbabe-ras pbabe-puro H-rasV12 Scott Lowe pbabe-празен pbabe-puro - Scott Lowe 3.1.5 Устройства и аксесоари BioPhotometer 8,5 mm Eppendorf, Германия Поточен цитометър (Флуоресценционно активирано сортиране на клетки, FACS) FACSCalibur Becton Dickinson, Германия Вграждащо устройство EG1160 Leica, Германия 25
Материали и методи Електрофореза Захранване E835 Consort, Белгия Устройство за обезводняване ASP300 Leica, Германия Инкубатор Steri-kult 200 Labotect GmbH, Германия Invisorb Плазмид Maxikit Invitek, Германия Камера Inteq, Германия Kryostat FrigoCut 2800 Reicher-Jung, Германия Microtom RM2035 Leica, Германия Микроскоп Микроскоп Leica, Германия, Германия Микроскоп за флуоресцентно оцветяване Zeiss Axioplan Mr. Frosty фризерна кутия (1 C в минута) Nalgene Labware Neubauer преброителна камера подобрена Дълбочина 0,1 mm Парафинови касети Superior Marienfeld, Германия Medite, Германия Стерилна банка Kendro HeraSafe Heraeus, Германия Азотен резервоар Thermolyne Scientific 6Plus Locator Термомиксер комфорт 1,5 ml Eppendorf, Германия Отоплителен шкаф Функционална линия Heraeus, Германия Центрофуга Eppendorf 5417 R Eppendorf, Германия Центрифуга Heraeus Megafuge 1.0 R Heraeus, Германия 26
Материал и методи 3.1.6 Произход на антитяло антиген Фирма разцепи каспаза 3/Asp175 Техника за сигнализация на заешки клетки, САЩ (# 9661) H3K9me 3 Rabbit Abcam, САЩ (ab8898) HP1 γ мишка Chemicon, САЩ (MAB3450) Ki67 мишка DAKO, Дания (M7240 ) P16 Mouse Novocastra, UK (NCL-p16-432) P53 Mouse Oncogene, Германия (OP43, AB-6) PAI-1 Mouse Novocastra, UK (Ncl-PAI-1) Phospho-Chk2 (Thr68) Техника за сигнализация на заешки клетки, САЩ (# 2661) Phospho-Erk 1/2 (Thr202/Tyr204) Техника за сигнализация на заешки клетки, САЩ (# 4376) Phospho-H2A.x (Ser139) Технология за сигнализация на заешки клетки, САЩ (# 2577) Фосфо-P53 (Ser15) Технология за сигнализация на заешки клетки, САЩ (# 9284) PML Mouse DAKO, Дания (M7202) Флуоресцентни вторични антитела Anti-Mouse IgG Goat GIBCO Invitrogen, Германия, (Alexa Fluor 594; A21121) Флуоресцентна мишка против BrdU GIBCO Invitrogen, Германия (MD5300 ) Втори антитела срещу заек Donkey Dianova, Германия LSAB-AP Kit Dako, Дания (K0689) LSAB-HRP Kit Dako, Дания (K0690) 27
Материал и методи 3.2 Методи Фигура 6 предоставя преглед на експерименталната настройка и времето на отделните стъпки Фигура 6: Преглед на метода. Преглед на отделните стъпки от експериментите. Стъпка А: Производство на контроли за остаряващия фенотип от IMR90 фибробласти. IMR90 бяха ретровирусно заразени с ras или празен вектор. След края на селекцията те бяха оставени в културата за шест дни. През това време се появи остаряващият фенотип на IMR90ras, докато IMR90empty продължи да се размножава. Бяха проведени различни тестове за стареене, като криви на растеж, анализ на SA-beta-Gal и анализ на клетъчния цикъл. Инфектираните клетки бяха замразени под удар като клетъчни гранули или за криоконтрол, или дехидратирани за парафинови контроли и вградени в парафин. Стъпка В: IMR90 криоконтроли и колоректални криогенни тъкани (5 нормални тъкани, 12 аденоми, 6 карциноми) бяха изследвани за стареене с SA-бета-Gal анализ и имунохистохимично откриване на Ki67. Стъпка C: IMR90 парафин 28