От Медицинска клиника и Поликлиника II - Großhadern
От Медицинска клиника и поликлиника II - Großhadern на Ludwig-Maximilians-Universität München Komm Режисьор: проф. Д-р мед. A. L. Gerbes ефект на силно намаляване на теглото (диета срещу стомаха на ръкава) върху възпалението и метаболизма на глюкозата при пациенти със затлъстяване с диабет тип 2 Дисертация за придобиване на докторска степен по медицина в Медицинския факултет на Университета „Лудвиг Максимилианс“ в Мюнхен, представена от Катрин Видински от Мюнхен 2015 г.
С одобрението на Медицинския факултет на университета в Мюнхен Репортер: проф. Д-р мед. Клаус Г. Пархофер Съдокладчик: Priv. Доз. Д-р Максимилиан Биелогуби проф. Д-р Кристин Майзингер Съвместно ръководство от служител на доктор: д-р мед. Бенедикт Аулингер Декан: проф. Д-р мед. вдлъбнатина. Reinhard Hickel Устен ден за изпит: 19 ноември 2015 г.
Affidavit С настоящото заявявам вместо клетва, че съм написал тази дисертация по темата за ефекта от силната загуба на тегло (диета срещу стомаха на ръкава) върху възпалението и метаболизма на глюкозата при пациенти със затлъстяване с диабет тип 2, че не съм използвал други помощни средства освен посочените и че съм направил всички констатации които са поети изцяло или приблизително от литературата, маркирани като такива и идентифицирани индивидуално според техния произход чрез назоваване на източника. Също така заявявам, че дисертацията, представена тук, не е била изпратена в същата или в подобна форма на друга институция с цел получаване на академична степен. Място, дата Подпис на докторант
Съдържание A Въведение. 1 I Затлъстяване, диабет и атеросклероза. 1 II възпаление. 1 III Важни пептиди в генезиса на диабет и атеросклероза. 4 IV Терапевтични възможности. 8 1 Консервативни възможности за лечение. 8 2 Опции за хирургично лечение. 8 2.1 Ограничителни процедури. 9 2.2 Ограничителни процедури с малабсорбиращи компоненти. 9 2.3 Малабсорбционни процедури с ограничителен компонент. 9 V Въпроси и цели. 11 Б Материал и методи. 12 I материал. 12 II методи. 17 1 Клинично-експериментална част. 17 1.1 Дизайн на проучването и участници. 17 1.2 Процедура и посещения. 18 1.3 Хирургия на стомаха на ръкавите и диета. 19 1.3.1 Група стомашни ръкави. 19 1.3.2 Диетична група. 20 1.4 Хипергликемична и хиперинсулинемична - евгликемична скоба. 20 1.4.1 Хипергликемична скоба. 21 1.4.2 Хиперинсулинемична - евгликемична скоба с биопсия на мастната тъкан. 22 2-ра част от лабораторния експеримент. 23 2.1 Elisa и фотометричен метод за измерване. 23 2.2 Полимеразна верижна реакция. 23 2.2.1 Извличане на РНК, включително смилане на DNase. 23 2.2.2 Обратна транскрипция - PCR (RT - PCR). 24 2.2.3 Качествен PCR. 25 2.2.4 количествена PCR в реално време (qrt-PCR). 26 I.
3 хистология. 28 4 статистическа оценка на резултатите. 28 C резултати. 29 I Основни данни за участниците в проучването. 29 II Доставка на енергия и състав на храните. 30 III Развитие на ИТМ и промяна в обиколката на талията. 32 IV промяна в кръвната захар на гладно, HbA1c и лекарствата. 33 V Оценка на скобите като основа за определяне на инсулинова резистентност. 36 VI Промяна в инсулиновата чувствителност. 37 VII Промяна в параметрите на възпалението. 40 VIII Хистологичен анализ на мастната тъкан. 51 D Дискусия. 53 I Прием на енергия и отслабване. 53 II Подобряване на метаболизма на глюкозата. 54 III Промяна в възпалението. 56 IV Промяна в NT-ProBNP. 59 V Алтернативни обяснения за подобряване на метаболизма на глюкозата. 60 VI Ограничения на изследването. 61 E Обобщение. 63 F Списък на съкращенията. 68 G Списък на фигурите. 70 H Списък на таблици. 72 I Библиография. 73 J Благодарности. 83 II
Ниско рестриктивен компонент, който се използва главно при пациенти с ИТМ> 50 kg/m 2 (1, 75). За всички описани лапароскопски процедури периоперативната смъртност е под 1% и изборът на интервенция зависи от множество фактори (напр. ИТМ, възраст, съпътстващи заболявания) (1). Общото между всички процедури е важността на близките следоперативни грижи, за да се гарантира трайна загуба на тегло и да се предотвратят симптоми на дефицит (1, 75). Фиг. 2а: Стомашна лента, взета от (1) Фиг. 2b: Ръкавен стомах, взета от (1) Фиг. 3a: Roux-en-Y Стомашен байпас, взета от (1) Фиг. 3b: Билиопанкреатична диверсия с дуоденален превключвател, взета от (1) 10
Зареждащ буфер ДНК 6x 10mM Tris (ph 7.6), 0.03% (w/v) бромофенолно синьо, 0.03% (w/v) ксилолов цианол, 60% (v/v) глицерин, 60 mm EDTA PBS 10 x ( ph 7.4) 1,37 M NaCl, 26,8 mm KCl, 81 mm Na 2 HPO 4, PBS 1x (ph 7,4) реагент разредител (ph 7,4) TAE 1x TAE 50x гелове агарозен гел (1 %) 14,7 mm KH 2 PO 4 10% (v/v) PBS (10x) 10% (v/v) PBS (10%), 1% (w/v) BSA 2% (v/v) TAE (50x) 2 M Tris, 1 M ледена оцетна киселина, 0,05 M EDTA агароза LE в TAE 1x, комплекти етидиев бромид За използваните комплекти, използваните разтвори и буфери са използвани съгласно протокола на производителя. Без RNase DNase Set Qiagen, Hilden, Германия RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Германия SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Karlsruhe, Германия Ензим При използване на ензими се използват разтвори и буфери, препоръчани и доставени от производителя. AmliTaq Gold DNA Polymerase Applied Biosystems, Carlsbad, USA (5U/µl) Deoxyribonuclease I, Amplification Invitrogen, Karlsruhe, Germany Grade (1U/µl) Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen, Karlsruhe, Germany (5 U/µl) PCR Primer Eurofins MWG Operon, Ebersberg) Последователност на грунд (5-3) GAPDH (hm) напред agggctgcttttaactctggt GAPDH (hm) обратна ccccacttgattttggaggga 13
Анализи за експресия на TaqMan (Applied Biosystems, Карлсбад, САЩ) Референтен номер на целевия ген (човек) Номер на поръчка TNF алфа NM_000594.2 Hs00174128_m1 MCP-1 NM_002982.3 Hs00234140_m1 IL-6 NM_000600.3 Hs00985639_m1 NM1391M1 N1111000 FN1 Фибронектин NM_002026.2 Hs00365052_m1 Адипонектин NM_001177800.1 Hs00605917_m1 RBP4 NM_006744.3 Hs00198830_m1 Vaspin (Serpina12) NM_173850.2 Hs005451801_m1 Референтен номер N1 A1, N1 референтен номер измерено по клинична химия в болницата. Винаги са се използвали комплекти Elisa за проби от човешка плазма. Параметри Производител Номер на поръчка TNF-свръхчувствителен R&D Quantikine KHC3014 Leptin R&D Quantikine DLE00 MCP-1/CCL2 R&D Quantikine DCP00 Adiponectin R&D Quantikine DRP300 Resistin R&D Quantikine DRSN00 Fibronectin Abcam AB1088948N48 AB48-ABN-ABN-ABN-ABP-AB10-ABP-ABN-ABP-ABN-ABP-ABN-ABP-ABN-ABP-ABN-ABB-ABP AB-ABR-ABP AB-ABP-ABN НИРД Quantikine HS600B 14
2.2.2 Обратна транскрипция - PCR (RT - PCR) Тъй като РНК не може да функционира като шаблон за ДНК полимеразата, първо трябва да се транскрибира в cdna (копиране на ДНК) (обратна транскрипция). Това беше направено, като се използва системата за синтез на първа верига SuperScript III за RT-PCR от производителя Invitrogen. Обратната транскрипция се комбинира с PCR за усилване на cdna. Подход 1 е използван за РНК денатурация и е показан в Таблица 2. Тъй като концентрацията на изолирана РНК от биопсичната мазнина е много ниска, 8 µl съответства на максималното количество РНК, което е на разположение. След инкубация в продължение на 5 минути при 65 ° С и охлаждане за 1 минута върху лед, беше добавена втората партида, компонентите на която са изброени в Таблица 3. След това стартира програмата RHRT PCR, както е посочено в таблица 4. Таблица 2: Реакционна смес (проста) за РНК денатурирана ДНКаз-усвоена РНК проба 8 µl Случайна хексамерна буква 1 µl dntp s (10 mm) 1 µl 10 µl Таблица 3: Реакционна смес (проста) за cdna синтез смес 10 x RT буфер 2 µl MgCl2 (25mM) 4 µl DTT (0,1 M) 2 µl RNaseOUT 1 µl SuperScript III RT 0,5 µl DEPC обработена вода 0,5 µl 10 µl 24
Таблица 4: PCR програма за обратна транскрипция в PCR термоциклер Температура Продължителност Стъпка 25 C 10 мин. Отгряване 50 C 50 мин. Синтез на Cdna 85 C 5 мин. Прекратяване 4 C край 2.2.3 Качествена PCR За доказване на успешна транскрипция на усвоена DNase Проведена е качествена PCR за РНК в cdna. Човешкият GAPDH (глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа) е посочен като еталон. Използвана е Taq ДНК полимераза (рекомбинантна, 5U/μl) от Invitrogen и реагентите, съдържащи се в комплекта (табл. 5). Програмата за PCR беше извършена в PXE 0.2 Thermal Cycler (Thermo Electron Corporation) и може да бъде намерена в Таблица 6. Таблица 5: Реакционна партида (проста) за стандартна PCR (контролна GAPDH) 10x PCR буфер 2 µl dntp смес (10 mM) 0,4 µl MgCl 2 (50 mM) 0,6 µl праймер за 1 µl праймер rev 1 µl шаблон cdna 1 µl Taq ДНК полимераза (5U/µl) 0,2 µl ddh 2 O 14 µl 20 µl 25