Оценка на микровискозитета на клетъчните мембрани
Оценка на микровискозитета на клетъчните мембрани - Лекция, раздел Химия, Флуоресцентна спектроскопия, интензивността на поглъщане на светлина в единица обем на веществото е свързана с експериментално измерените стойности на добре познатата формула на Ламберт-Баер.
В предишния раздел беше посочено, че анизотропията на флуоресценцията силно зависи от вискозитета на разтвора, в който е разтворен флуорофорът. Именно тази връзка е довела до използването на измерване на анизотропия за оценка на микровискозитета в ацилната област на страничната верига на клетъчните мембрани. Избира се флуорофор, който се диспергира в такава неполярна среда. Като правило за тази цел се използват перилен, 9-винил антрацен, 2-метилантрацен [4, 12] и дифенилхексатриен [13]. Последното от тези вещества в момента е най-широко използвано по причини, които ще бъдат разгледани по-долу. Първоначално се избира подходящ референтен разтворител и се изгражда калибрационна крива - зависимостта на измерените стойности на анизотропия на флуоресценция от известния вискозитет на референтния разтворител. Типична калибрационна крива е показана на фиг. 5.11.
Фиг. 5.11. Калибрационна крива за оценка на микровискозитета на мембраната [12].
Представени са данните за анизотропията на перилен (1), 2-метилантрацен (2) и 9-винилантрацен (3) в минерално масло.
След това се измерва анизотропията на флуоресценцията за същия флуорофор, разпределен в ацилните странични вериги на липидния бислой. Вътрешният вискозитет на двуслоя се изчислява чрез сравнение с калибрационна крива. За малки ароматни молекули изглежда най-вероятно техният ефективен молекулен обем V да бъде еднакъв в разтворителя и в липидния бислой. В резултат на това калибрационната крива на r спрямо η в разтворител с известен вискозитет дава възможност да се свърже анизотропията на мембранно-свързания флуорофор с микровискозитета на мембраната.
Типичните резултати от микровискозитета, получени с използване на перилен, са показани на фиг. 5.12. Яйчният фосфатидилхолин е смес от ненаситени фосфолипиди, които не претърпяват фазови преходи в изследвания температурен диапазон. Привидният микровискозитет е нисък (крива 2) и монотонно се увеличава с промяна в К -1, Дипалмитоилфосфатидилхолинът е наситен фосфолипид, чийто фазов преход се отразява в рязко намаляване на микровискозитета, наблюдавано близо до 37 ° C (крива 1).
Фиг. 5.12. Резултати от определяне на микровискозитета на диспергираните фосфолипидни мембрани чрез измерване на анизотропията на перилен [12].
Привидните микровискозитети са дадени за дипалмитоилфосфатидилхопин (1), яйчен фосфатидилхолин (2) и DPPC + холестеролни смеси (3, 4), за които са посочени моларните съотношения.
Под температурата на преход липидните бислои, състоящи се от наситени липиди, трябва да бъдат доста вискозни. На фиг. 5.12 също така показва привидния микровискозитет на смесите DPPC + холестерол (криви 3, 4). Холестеролът обикновено увеличава привидния микровискозитет на мембраните. За определяне на микровискозитетите, показани на фиг. 5.11 за трите флуорофора като референтен разтворител се използва минерално масло. За всяка от тези системи са получени еквивалентни микровискозитети, което увеличава надеждността на получените стойности. Би било по-желателно обаче да се използват три различни референтни разтворители, отколкото да се изследват три различни системи, тъй като в този случай експериментите биха разкрили връзката между скоростта на въртене на флуорофорите и макроскопичния вискозитет на разтворителите [14].