Оценка на микроваскуларната функция на човешката мастна тъкан с помощта на протокол за видеомикроскопия

Обобщение

Системите за видеомикроскопия се използват за изследване на функционалните свойства на изолираните артериоли на мастната тъкан в отговор на физиологични и фармакологични стимули. Тази техника може да се използва за изследване на микроваскуларни фенотипове в различни домени на мастната тъкан при затлъстели хора.

Резюме

Въведение

Нашата лаборатория прилага видеомикроскопия за изследване на връзката между затлъстяването и съдовата дисфункция, с акцент върху ефектите на различни домени на мастната тъкан върху васкулатурата. Централното затлъстяване с натрупване на интраабдоминална висцерална мазнина е най-вероятно свързано с производството на адипоцитокини, метаболитни нарушения и кардиометаболитен риск. Предполага се, че дисфункцията на мастната тъкан със свръхпродукция на про-атерогенни цитокини и дисрегулация на адипокин са силно включени в тези процеси, но някои регулаторни молекули и цели на лечението остават до голяма степен неоткрити. 4 Между другото, на ниво локална мастна тъкан, изтъняването на капилярите и нарушеният кръвен поток са свързани с псевдохипоксия на мастната тъкан и метаболитна дисрегулация. Хипотезата, че сърдечно-съдовите заболявания се развиват вероятно резултат от дисфункция на мастната тъкан. Проатерогенните медиатори, освободени от мазнини, особено във връзка със средно/висцерално затлъстяване, вероятно насърчават ендотелната дисфункция и патогенните съдови промени, които могат да се проявят локално в мастната васкулатура и откриване, използвайки методологията, описана тук. 5

Функционалната оценка на изолираните артериоли на мастната тъкан е полезен подход за разбиране на патофизиологията и молекулярните механизми, които допринасят за съдова дисфункция при затлъстяването при хора. За да изследваме механизмите, които допринасят за специфичната дисфункция на мастните депа, използвахме методи за тестване на ендотелийно зависимите и независими вазодилататорни отговори от микроваскулатурата и оценява експресията на различните регулаторни кандидати в куплирани висцерални и подкожни (SC) проби от мастна тъкан Затлъстели субекти по време на бариатрична хирургия.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Протоколът и примерите, описани тук, са одобрени от Институционалния съвет за преглед на Университета в Бостън (IRB, Протокол № H-25644) и са направени в съответствие с Декларацията от Хелзинки. Всички участници са предоставили писмено съгласие преди участие.

1. Пригответе разтворите и микро-стъклените канюли

2. Пригответе реагентите

  1. приготвя се ацетилхолинът (ах, 10 -2 М, изходен разтвор). Разтворете 18,29 g в 10 ml дейонизирана вода. Запазете 1 ml аликвотни части от изходния разтвор (10 -2 M) при -80 ° C. Серийно се разрежда в деня на експеримента, за да се получат следните работни концентрации: 10 -5, 10 -9, 10 -6, 10 -7, 10 -8 ст.
  2. Пригответе папаверин (2 х 10 -2 М, изходен разтвор). Разтварят се 0,07517 g в 10 ml дейонизирана вода. Приготвят се 10 µL аликвотни части от изходния разтвор и се разреждат последователно при -80 ° C, за да се получат 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7 10 -8 М в деня на експеримента.
  3. Пригответе ендотелин-1 (ET-1, 2 х 10 -5 М, изходен разтвор). Разтворете 50 µg ендотелин-1 в 1 mL 1% BSA/PBS. Запазете 1 ml аликвотни части от основния разтвор (2 x 10 -5 M) при -80 ° C. Разредете в деня на експеримента, за да получите работна концентрация от 10 -10 M в деня на експеримента.
  4. Съхранявайте реагентите при -20 ° C или до -80 ° C в зависимост от вида на фризера, но не повече от 6 месеца.

3. Събиране на мастна тъкан и подготовка на съдовете

4. Оценка на микроваскуларната функция със затлъстяване

Забележка: най-общо зависимата от мастна артериоларна ендотелиална вазодилатация може да бъде предизвикана в отговор на физиологични (индуцирани от потока) и фармакологични стимули (индуцирани от Ach).

  1. Посредническа от потока, зависима от ендотел вазодилатация
    1. след налягане, запишете диаметъра на мастната артериола в покой (Di). Това се нарича основен диаметър в покой.
    2. Предварително кръвоносните съдове се свиват,

    55% от изходния диаметър на почивка (Dp) чрез добавяне на 1 µL ендотелин-1 (ET-1, 10-10 М) директно във ваната и изчакване за 5 минути. Повторете този процес, докато постигнете желания

    5. Анализ и изчисление на данните

    1. изчислете съдовата реактивност. Използвайте Процентна вазодилатация за разпечатване на данни, обмислете базовите разлики в диаметъра на съда и изчислете, като използвате следното уравнение:
      % Вазодилатация (DT-Dp/Di-Dp) x 100 =
      където DT е регистрираният диаметър в даден момент от времето (максимален диаметър), Dp е диаметърът, записан след добавянето на вазоконстрикторния агент (т.е. ET-1 причинява стесняващ се диаметър), а Di е диаметърът, който е бил непосредствено преди добавянето на вазоконстрикторния агент записан (диаметър на базовата линия в покой). 9
    2. Определете вазодилатационната и вазоконстрикционната чувствителност (доза-отговор) към агонист като концентрацията на Ach, папаверин или ET-1, която предизвиква 50% от максималния отговор (EG 50), определен от сигмоиден параметър и начертан, както е описано по-горе. 10
      ЗАБЕЛЕЖКА: проучванията за възпроизводимост между наблюдатели на вазодилатация на мастните микросъдове имат висок коефициент на корелация (CC) от 0,99 (n = 10 експеримента на Шиф) в нашата лаборатория.

    1. Изразявайте непрекъснати измервания, тъй като ± SEM означават, че те обикновено са нормално разпределени. Анализирайте съдовата реактивност в мастните артериоли чрез многократно действие двупосочно ANOVA.
    2. Като алтернатива, сравнете площта под кривата (AUC) на действие за кумулативна вазодилатация с дозовите реакции между лекуваните групи. Във всички случаи, помислете за задължителен P абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    Нашата лаборатория използва видеомикроскопия, за да изследва ендотел-зависимата и независима вазодилатация, както и вазоконтрактилната функция на мастната тъкан, изолирани артериоли от подкожна и висцерална мастна тъкан от затлъстели хора. Характерната експериментална настройка е показана на фигура 1АПоказва. Артериолите на мастната тъкан са окачени между две капилярни стъклени пипети и са закрепени с конци в камерата на органа, както е показано на фигура 1bпоказани. Както е описано по-горе в раздел 5.1, артериоларните отговори след това могат да бъдат оценени чрез изследване на съда на изходно ниво (Фигура 2А), последвано от предварително стесняване с ET-1

    55% от диаметъра на базовата линия (фиг. 2 b) и след това индуцирана от агонист вазодилатация и отпускане на съдовия лумен, както е показано на фигура 2показани.

    човешката
    Фигура 1: Структура на видеомикроскопията. (А.) Изображение, изобразяващо компонентите на камерата на органа за видеомикроскопия. (Б.) Изображение на артериола от човешка мастна тъкан, монтирана между две стъклени капилярни пипети в камерата на органа. Диаметърът на Шиф се променя в отговор на физиологични и фармакологични стимули, които могат да бъдат изследвани и количествено определени с помощта на софтуер за анализ и приставка за обърната камера, специализирана в системата. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

    функция
    Фигура 2: Визуализация на микроваскуларна вазодилатация с видео микроскопия под налягане. (А.) диаметър на изходните артериоли в покой (диаметър след налягане, без агонист или стимулация: вторник) (Б.) вече стеснени диаметри (след индуцирани стеснени диаметри ET-1: Dp), (° С.) Агонистично индуцирано намаляване на диаметъра (след добавяне на Ach: DT). Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

    функция
    Фигура 3: Зависима от ендотел и независима вазодилатация в подкожна vs. артериоли на висцералната мастна тъкан при затлъстели хора. Зависимата от ендотел вазодилатация е значително отслабена във висцералната в сравнение с подкожната мастна артериола от (А.) Оценка на увеличен поток (сдвоени подкожни и висцерални съдове, n = 20), или (Б.) Отговор на дозата на ацетилхолин с/без L-NAME (сдвоени подкожни и висцерални съдове, n = 16). (° С.) Независимата от ендотел вазодилатация не се променя различно между висцералните и подкожните артериоли, когато се оценява реакцията на дозата на папаверин (сдвоени подкожни и висцерални съдове, n = 8). * Показва групови разлики между депата; † Обозначава специфични за депо разлики между ацетилхолин с L-NAME в сравнение с ацетилхолин самостоятелно; NS: не е значително. Данните са представени като Средно ± SEM, p Необходим абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Дисекцията и изолирането на затлъстелите артериоли от околните тъкани може да бъде времеемък и трудоемък процес с внимателно внимание към детайлите и техническия протокол. Процедурата за микродисекция изисква внимателни умения и специализирани дисекционни принадлежности, за да се избегнат възможни увреждания на гладката мускулатура или ендотелните слоеве на микроваскуларната клетка. Дори и най-малката случайна пункция в артериоларната стена може да предотврати интралуминалното налягане и да доведе до неуспешен опит. В допълнение, канюлирането на артериолите с конци е от решаващо значение за фиксирането на артериолите между стъклата на капилярната пипета във всеки край на съда.

    Човешките изолиращи микросъдове могат да развият спонтанен миогенен тонус след 30-40 минути налягане при 60 mmHg. Установихме обаче, че човешките мастни артериоли с размер обикновено 50-350 µm с вътрешен луминален диаметър са сравнително малки с оскъдни слоеве на съдови гладкомускулни клетки и не са склонни да развиват значителен миогенен тонус в сравнение с артериолите на скелетните мускули. По този начин ние задействаме предварителното стесняване на тези малки артериоли с ET-1 преди излагане на вазодилататори. Ние откриваме, че ET-1 проявява по-надежден вазоконстрикторна реакция, докато в някои случаи може да има променливост в отговорите на алго рецепторните агонисти като фенилефрин. Наложително е да се използва подходящият агонист, за да се индуцира желания

    55% предварително избиране за избор; Важно е обаче също така да се избере точното количество предварително стесняващо средство спрямо дозата и да се предотврати токсично увреждане на съда. За да постигнем това, започваме с най-долния ред на дозата и титруваме, както е описано в раздел 4.1.2.

    Артериолите в мастната тъкан са чувствителни към промени в рН и температурата; Следователно е от решаващо значение да се наблюдава и контролира подходящото рН (7.4) и температура (37 ° C) по време на експерименталната процедура. Докато видеомикроскопията е строго контролирана контролирана температура, наложително е да се следи рН на разтвора в експеримента, за да се избегнат промени, които могат да изкривят резултатите. Непрекъснатите мехурчета от разтвора CANCER и разтвора за замяна на всеки 15 минути по време на стъпките под налягане и измиване ще намалят колебанията на pH с течение на времето.

    Видеомикроскопията е полезна техника за изследване на функционалните свойства на микроваскулатурата, техниката има значителна крива на обучение и потенциално трудоемка, особено по време на процеса на съдова изолация. В зависимост от вида на тъканите, които се биопсират, нашият опит с микроваскулатурата на мастната тъкан показва, че процедурата за канюлация може да отнеме значително време и търпение. Освен това има присъща чувствителност във времето към експериментите, тъй като съдовете извън тялото са склонни да губят своите физиологични и функционални свойства с течение на времето. По този начин експериментите трябва да се извършват в жизнеспособните прозорци на съдовете минути до часове след хирургична биопсия, преди да се разпадне тъкан.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Разкриване

    Авторите нямат подробности или конфликт на интереси, които да докладват.

    Благодарности

    Авторите биха искали да благодарят на доброволците за участието в тези проучвания и на персонала на операционната зала в Бостънския медицински център за предоставяне на биопсии на мастна тъкан. Д-р Gökce се подкрепя от Националните здравни институти (NIH) Grants, HL081587, HL114675 и HL126141. Д-р Цветът разчита на гранта на NIH K23 HL135394.