Нов ваксинационен потенциал на rv3131, кодирана от dosr-регулон предполагаема нитроредуктаза, срещу
субекти
абстрактно
Въведение
В това проучване ние изследвахме имуногенността и защитните ефекти на Rv3131, формулиран в GLA-SE (Glucopyranosyl Lipid Adjuvant Stable Emulsion), добре дефиниран TLR4 адювант, като ваксинна платформа за субединици срещу хипервирулентна експозиция на Mtb K.
Резултати
Транскриптът rv3131 се регулира нагоре във фазата на експоненциален растеж, в хипоксично състояние и в макрофаги, независимо от фазата на растеж във вирулентния Mtb изолат
38 kDa от Rv3131 бяха потвърдени чрез електрофореза на натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) и Western blot (1c).
( а ) Нивото на експресия на rv3131 беше оценено с помощта на qRT-PCR. Различните промени в сгъването между Mtb H37Rv (светлосива лента) и Mtb K (тъмно сива лента) при различни условия на растеж, експоненциална фаза и условия на хипоксична култура бяха определени с помощта на ΔΔCt метода и експресията на 16 S rRNA беше използвана като ендогенен контрол. Rv3133c (dosR) се използва като положителна контрола. ( б ) QRT-PCR също се използва за rv3131 експресия на Mtb в BMDM. Различните промени в сгъването между Mtb H37Rv (светлосива лента) и Mtb K (тъмно сива лента) бяха определени с помощта на ΔΔCt метода и експресията на 16 S rRNA беше използвана като ендогенен контрол. Rv3133c (dosR) се използва като положителна контрола. ( ° С ) Coomassie blue оцветени 10% SDS-PAGE с рекомбинантен Rv3131 протеин (ляв панел), пречистен при условия без ендотоксини и потвърден чрез Western blot с антихистидиново антитяло (десен панел). М: стандартен маркер за молекулно тегло.
Имуногенност и имунологична памет, индуцирана от Rv3131 имунизация
Всяка група мишки бяха имунизирани и евтаназирани, както е описано в раздела Методи. Четири седмици след последната имунизация, мишките от всяка група бяха умъртвени и техните белодробни и далачни клетки бяха третирани с Rv3131 (5 μg/ml) при 37 ° С в продължение на 12 часа в присъствието на Golgi Stop. ( а ) Стратегията за затваряне, използвана за идентифициране на специфични за Ag многофункционални популации от Т клетки. ( б ) Когато се стимулира с Rv3131 ваксина Ag, процентите на Ag-специфични, многофункционални CD4 + CD62L и CD8 + CD62L Т клетки, които произвеждат TNF- & agr;, IFN- & ggr; и/или IL-2, произвеждащи в белите дробове и далака клетки от всяка имунизирана група, се оценяват с помощта на поточна цитометрия. Средните честоти на клетките, продуциращи ефекторни цитокини, са показани като кръгови диаграми. Резултатите са изразени като средно ± SD за 5 мишки от всяка група. Значимостта на разликите се определя с несдвоен t-тест. Р-стойност
В допълнение, обширните генетични вариации могат да доведат до променена ефикасност на ваксината и пътища на генна експресия, които са важни за развитието на ваксината срещу туберкулоза. Например, Cohen et al. прогнозира, че непълно разбиране на разнообразието от микобактериални щамове може да има значително отрицателно въздействие върху ефективността на ваксината, тъй като ваксината замества нецелевите варианти на Mtb със щама 38. Освен това Homolka et al. предполага, че генетичното разнообразие в щамове Mtb засилва необходимостта от справяне с предизвикателството при използването на различни щамове Mtb като обща стъпка при тестване на ваксини и тестване на лекарства 39 .
Поради това предположихме, че преобладаващият в клинично отношение Mtb генотип и щам свръхекспресирани Ags може да са добри целеви Ags ваксини. И накрая, чрез анализ на микрочипове на генни транскрипти, ние установихме, че Rv3131 отговаря на горния стандарт сред кодираните с DosR регулон гени. Доколкото ни е известно, това е първият път, когато Rs3131, свързан с DosR regulon, е ефективен срещу предизвикателството със силно вирулентен клиничен щам Mtb от Пекин.
В това проучване изследвахме дали Rv3131 произвежда Ag-специфичен IFN-γ по време на Mtb K инфекция. -Реакция (2а) и какъв тип Т-клетъчен отговор се предизвиква чрез ваксиниране с Rv3131 и GLA-SE (2, 3 и 4) 5) преди и след предизвикателството. Нашето проучване показа, че Rv3131 индуцира Ag-специфичен IFN-γ отговор по време на Mtb K инфекция и че ваксинирането с Rv3131 и GLA-SE индуцира силен Ag-специфичен отговор на Т-клетъчната памет. В допълнение, ваксината срещу субединицата Rv3131 индуцира стабилна и устойчива Th1-базирана реакция на паметта (Фиг. 2, 3 и 5) и сравним защитен ефект срещу Mtb K за разлика от BCG-индуцираната защита като ваксинация срещу единична Ag субединица 4 Седмици след ваксинацията. Инфекция (фиг. 4).
Наскоро Zvi et al. съобщава, че 189 гена от 3989 продукти на ORF от генома на Mtb са били избрани in silico като предполагаеми кандидати за ваксина въз основа на набор от данни за генома, създаден чрез обширно извличане на данни и биоинформатика 44. Сред 189-те кандидати за ваксина, Rv3131 и Rv3127, друга кодирана с DosR регулон нитроредуктаза и вторият най-висок ген в нашето проучване на профила на транскрипция са включени в списъка на 45-те най-добри попадения. В допълнение към теоретичния анализ, експерименталните доказателства показват, че Rv3131 е T-клетъчен Ag. Например, Rv3131-индуцирани, Mtb-специфични Т-клетъчни имунни отговори са съобщени при туберкулинови кожни тестове, но не и при здрави контроли или пациенти с туберкулоза 45. Като друг пример, Rv3131 демонстрира най-много имуногенен потенциал на Ag в сравнение с другите свързани с DosR Ags, тествани за способността им да индуцират IFN-γ в латентно заразена гамбийска популация 46 .
В обобщение, настоящите ни данни показват, че кодираният с DosR Rv3131, нов целеви Ag за разработване на ваксина срещу туберкулоза, има потенциал като ефективна ваксина Ag, като отговаря на следните критерии: конститутивна и стабилна експресия в хипервирулентен пекински Mtb; способността да бъде разпозната от имунната система по време на in vivo инфекция; способността да индуцират Ag-специфични, Th1 пристрастни многофункционални Т клетки; и ефективност срещу хипервирулентни Mtb щамове. Следователно, Rv3131 може да бъде отличен кандидат за употреба във ваксина с множество антигени на субединица Mtb, особено като се има предвид ограничената ефективност на BCG ваксината срещу семейството в Пекин.
Методи
Животни
Всички експерименти с животни са извършени в съответствие с насоките и разпоредбите на Корейската администрация по храните и лекарствата (KFDA). Експерименталните протоколи бяха разгледани и одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните (номер на разрешителното: 2015-0041) към здравната система на университета Йонсей (Сеул, Корея). След одобрение на опитите, женски мишки C57BL/6 без патоген (SPF) на възраст 6-7 седмици бяха закупени от Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Япония) и настанени в BSL-3 съоръжение при бариерни условия в Avison Biomedical Research Център към Медицински колеж Йонсей.
Бактериални щамове и производство на бактериална РНК
Експерименти и анализи с микрочипове
Плъзгачите за олигореси от Mtb бяха любезно предоставени от Dr. Стефан Н.Е. Кауфман (Институт по инфекция на Макс Планк, Берлин, Германия). РНК маркирането и хибридизацията на масива се извършват, както е описано по-горе 59. Хибридизираните слайдове бяха сканирани със скенер за микрочипове GenePix 4000B (Axon Instruments, Калифорния, САЩ) и интензитетът на петна беше идентифициран и количествено определен с TM4 Microarray Software Suite (//www.tm4.org). Точковите интензитети на сигнала бяха нормализирани в MIDAS, използвайки опциите на алгоритъма LOWESS и общата интензивност на полето. За статистическия анализ бяха използвани четири биологични репликиращи масива за експоненциални условия на растеж и три биологични повторения за хипоксични културни условия.
Генериране на BMDM и ин витро инфекция
BMDM са генерирани, както е описано по-рано 61. След 6 дни диференцирани BMDM бяха заразени с Mtb H37Rv и K при MOI от 10 за 24 часа.
Потвърждение на експресията на rv3131 чрез qRT-PCR
Общо Mtb H37Rv и K-RNA бяха извлечени от фазата на експоненциален растеж при хипоксия и инфектирани с Mtb BMDM, използвайки Trizol, както е описано по-горе. След това cDNA се синтезира, използвайки RT & GO master mix (MP Biomedicals, Германия), съгласно препоръките на доставчика. След синтез, диференциалната генна експресия между Mtb H37Rv и K беше измерена с помощта на qRT-PCR, както беше описано по-рано 62. Накратко, qRT-PCR беше извършена върху PCR система в реално време на StepOnePlus ™ (Applied Biosystems, Калифорния, САЩ), използвайки SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Takara Bio Inc., Shiga, Япония). qRT-PCR се извършва, като се използват следните набори праймери; rv3131 напред, 5'-GTGCCCTAGACCGAATGAAA-3 'и назад, 5'-TAGCGCCCACTCCAAATG-3', dosR (rv3133c) напред, 5'-AGACATCAAGGGAATGGAGTTG-3 'и назад, 5'-TGGTCGTAAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCAGGTCGG 3 'и назад, 5'-CGGGACTTAACCCAACATCTC-3'. Промяната на гънките в генната експресия между Mtb H37Rv и Mtb K беше изчислена, използвайки метода ΔΔCt и 16 S rRNA беше използвана за нормализиране. Три биологични повторения бяха използвани за статистически анализ.
Експресия и пречистване на рекомбинантен Rv3131 протеин
Имунизация на мишки
Мишките C57BL/6 бяха имунизирани чрез три интрамускулни инжекции с интервал от три седмици. Всяка имунизация съдържа 5 μg рекомбинантен протеин Rv3131 с 5 μg GLA-SE (глюкопиранозил липиден адювант), формулиран в стабилна емулсия масло във вода (SE) от IDRI (Институт за инфекциозни заболявания). GLA-SE беше любезно предоставен от IDRI (Сиатъл, Вашингтон, САЩ). За имунизация с BCG, мишките се инжектират подкожно с 2 × 105 CFU BCG Pasteur 1173P2. Контролната група мишки се имунизира само с GLA-SE. Клетките на далака и белите дробове бяха събрани и използвани за анализ на имуногенността 4 седмици след последната имунизация.
Mtb инфекция
Четири седмици след последната имунизация, адювантният контрол (GLA-SE) и ваксинираните мишки (BCG, Rv3131/GLA-SE) бяха аерогенно заразени с щама Mtb K, както е описано по-горе 63. Накратко, мишките бяха изложени на Mtb К в продължение на 60 минути в инхалационната камера на устройство за въздушна инфекция (Glas-Col, Terre Haute, IN), калибрирано за доставяне на предварително определена доза. За да се потвърди първоначалното бактериално натоварване, един ден по-късно бяха евтаназирани четири мишки и приблизително 150 жизнеспособни бактерии бяха освободени в белите дробове на всяка мишка.
Измерване на цитокини
Единични клетки, приготвени от далак и бели дробове на инфектирани с Mtb или имунизирани мишки, бяха стимулирани с Rv3131 (5 μg/ml) или PPD (2 μg/ml) за 24 часа при 37 ° C. PPD беше любезно предоставен от Dr. Brennan at Aeras (Rockville, MD, USA). Нивата на секретиран IFN-γ (eBioscience, Сан Диего, Калифорния), IL-4 и IL-5 (BD Bioscience, Сан Диего, Калифорния) в супернатантата на културата бяха открити с помощта на търговски комплект ELISA в съответствие с инструкциите на производителя.
Титър на антителата в серума
Специфичните за Rv3131 IgG1 и IgG2c реакции в серума са оценени, както е описано по-рано 63. Накратко, 96-ямкови плаки бяха пълни с 2. g/ml Rv3131 с покритие; Като вторично антитяло се използва конюгирано антитяло от хрян (HRP) срещу IgG1 (BD Bioscience, Сан Диего, Калифорния) или IgG2c (Southern Biotech, Birmingham, AL). Оптичните плътности (OD) се определят при 495 nm в рамките на 15 минути след края на реакцията.
Анализ на субпопулации на Т клетки
Едноклетъчни суспензии на белодробни и далачни клетки се приготвят, както е описано по-рано 65. Едноклетъчните суспензии бяха блокирани първо с анти-CD16/32 за 15 минути при 4 ° С. След като клетъчната повърхност е покрита с LIVE/DEAD ™-фиксируем комплект Aqua-Dead-Cell (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), Brilliant Violet 421 (BV421) -конюгиран анти-CD3 & epsi; -Перидинин-хлорофил (PerCP) -Cy5,5-конюгиран анти-CD4, алофикоцианин (APC) -Cy7-конюгиран анти-CD8 (BD Bioscience, Сан Диего, Калифорния), фикоеритрин (PE) -конюгиран анти-CD44, APC конюгирано анти-CD127 и флуоресцеин изотиоцианат (FITC) конюгирано анти-CD62L (eBioscience, Сан Диего, Калифорния) антитяло за 30 минути при 4 ° C, броят на всеки тип Т-клетки на паметта е измерен с помощта на FACSVerse- Анализирани са поточни цитометри (BD Biosciences) и предлаган в търговската мрежа софтуер (FlowJo).
Вътреклетъчно оцветяване на цитокини
Едноклетъчни суспензии на имунизирани и заразени мишки (2 × 106 клетки) се стимулират с Rv3131 (5 μg/ml) или PPD (2 μg/ml) при 37 ° С в продължение на 12 часа в присъствието на GolgiStop (BD Bioscience). Клетките първо се измиват с PBS, блокират се с анти-CD16/32 блокиращо антитяло при 4 ° С в продължение на 15 минути и след това се оцветяват с белези с флуорохром-маркирани антитела срещу CD3, CD4, CD8 и CD62L, както и с LIVE/DEAD TM Fixable Aqua Dead Клетъчен комплект за 30 минути при 4 ° С. Като отрицателни контроли клетките се оцветяват на повърхността със съответния изотип съчетан имуноглобулин (Ig). Клетките се промиват с Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) в продължение на 30 минути при 4 ° С, фиксират се и се проникват. Клетките се промиват два пъти с Perm/Wash (BD Biosciences) и след това се оцветяват вътреклетъчно с APC-конюгиран анти-TNF-α, PE-конюгиран анти-IFN-γ и PE-Cy7-конюгиран анти-IL-2 (BD Biosciences) за 30 минути при 4 ° C. Клетките се измиват с Perm/Wash и след това се фиксират с IC фиксиращ буфер (eBioscience). След ресуспендиране в PBS, клетките се анализират с помощта на проточен цитометър.
Бактериално изброяване и хистопатологичен анализ
Статистически анализ
Всички in vitro резултати са представителни за поне три независими експеримента с постоянни резултати. Данните в графиките са представени като средно ± стандартно отклонение (SD). Данните от експеримента in vivo се отчитат като медиана с интерквартилен обхват (IQR). Сравненията между пробите бяха направени с помощта на несдвоен t-тест или еднопосочен ANOVA, последван от множество тестове за сравнение на Tukey, когато данните обикновено се разпределяха с Prism 5 (GraphPad Software версия 5, Сан Диего, Калифорния).
Допълнителна информация
Как да цитирам тази статия: Kwon, KW et al. Нов ваксинален потенциал на Rv3131, кодирана от DosR регулон предполагаема нитроредуктаза, срещу хипервирулентен щам Mycobacterium tuberculosis K. Sci. Представител. 7-ми, 44151; doi: 10.1038/srep44151 (2017).
Бележка на редактора: Springer Nature остава неутрален по отношение на исканията за юрисдикция в публикувани карти и институционални връзки.
Още информация
Word документи
Още информация
Забележки
Изпращайки коментар, вие се съгласявате с нашите условия за използване и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.