Модел на забавено инокулиране на протокол за хронична Pseudomonas aeruginosa инфекция на рани (в превод

Обобщение

Ние описваме протокол със забавено инокулиране, за да се получат хронични инфекции на рани при имунокомпетентни мишки.

Резюме

Въведение

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) е Грам-отрицателна пръчковидна бактерия с нарастващо значение за човешкото здраве и болести. Той е отговорен за широко разпространената заболеваемост и смъртност в нозокомиалните условия, особено при раните с инфекции при имунокомпрометирани пациенти 1, 2 Появата на мултирезистентни щамове на този патоген даде допълнителен тласък за изследване на фактори, допринасящи за вирулентността на P. aeruginosa, механизмите на антибиотична резистентност на P. aeruginosa и нови методи за превенция и лечението на този смъртоносен инфекция 3. Поради това необходимостта от животински модели на хронична инфекция на рани като инструменти за изучаване на тези изследователски въпроси никога не е била по-голяма.

За съжаление, много животински модели на инфекция с P. aeruginosa са склонни да имитират остра инфекция с бързо разрешаване на инфекцията или бърз спад поради сепсис 4, 5, което не имитира адекватно често хроничния характер на тези инфекции. За да се преодолее този недостатък, някои модели използват имплантиране на чужди тела като мъниста от агар, силиконови импланти или алгинатни гелове 6, 7, 8. Други модели използват мишки, които са имунокомпрометирани поради напреднала възраст, затлъстяване или диабет, или чрез фармакологични средства като индуцирана от циклофосфосфамид неутропения 9, 10, 11, 12. Въпреки това, използването на чужди материали или имунокомпрометирани гостоприемници вероятно променя локалния възпалителен процес, което затруднява разбирането на патофизиологията, свързана с хронични инфекции на рани при гостоприемници с иначе нормална имунна система.

Разработихме хроничен модел на инфекция на рани с P. aeruginosa при мишки, който включва забавено инокулиране с бактерии след ексцизионно нараняване. Отложеното инокулиране позволява експерименти за оценка на бактериалното натоварване, удължаващи се до най-малко 7 дни. Този модел отваря нови възможности за изследване както на патогенезата, така и на нови лечения на хронични инфекции с P. aeruginosa.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички методи, описани тук, са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) на Станфордския университет.

1. Подготовка и растеж на бактерии

  1. Извършете цялата работа с P. aeruginosa и животни с BSL-2 Предпазни мерки съгласно Институционалния комитет по биобезопасност на Комитета за изследване и насоките на Комитета за използване на животните. Извършете всички стъпки, описани тук, включващи P. aeruginosa, включително инокулиращи мишки, в шкаф за биобезопасност.
  2. Луминесцентният щам PAO1: lux на P. aeruginosa се предлага в нашата лаборатория при поискване. Нишка PAO1, съхранявана под формата на замразен глицерол върху агар Lysogeny Broth (LB). За луминесцентния щам PAO1: lux, LB агар трябва да съдържа селективни антибиотици (100 'g/ml карбеницилин и 12,5' g/ml канамицин). Растат при 37 ° C за една нощ в бактериален инкубатор.
  3. Изберете изолирана колония и отглеждайте една нощ при 37 ° C в 3 ml среда lb, pH 7,4. За луминесцентни щамове бульонът трябва да съдържа 100 og/mL карбеницилин. Растете в разклащащи се аеробни условия.

2. Подготовка на процедурата

  1. Нека всички служители, извършващи операцията, да носят чист лабораторен халат/палто, маска за лице, мрежа за коса и ръкавици.
  2. Автоклавирайте всички хирургически инструменти, включително ножици и форцепс. Използвайте асептична техника за стерилизация на инструменти между животни.
  3. Почистете хирургическата маса с етанол и подгответе чиста хирургическа завеса.

3. Епилация

4. Ексцизионна операция на рани с пълна дебелина

5. Инокулация с P. aeruginosa

6. Изображения in vivo на заразени рани

7. Следоперативно лечение

  1. Наблюдавайте мишките в съответствие с насоките, определени от протокола IACUC на изследователя. Наблюдаваме ежедневно всички мишки през първите 4 дни, след това през ден до края на експеримента. Претегляйте мишките веднъж дневно през първите 4 дни след операцията в BSC. Инжектирайте 250 l 0,9% натриев хлорид подкожно на 1 и 2 ден след инфекцията.
  2. Проверете за признаци на болка/дистрес при мишки, включително прегърбена стойка, мръсна козина, летаргия, затруднено дишане, гримаса на лицето и загуба на тегло.
  3. Ако животните показват признаци на влошено здраве, консултирайте се с ветеринарен лекар. Всяка мишка, която изглежда показва признаци на влошаване на болка/дистрес и загуба на тегло от 20% или повече, трябва да бъде евтаназирана.