Малките некодиращи РНК в регулона на двукомпонентната система CiaRH в Streptococcus
Малките некодиращи РНК в регулона на двукомпонентната система CiaRH в Streptococcus pneumoniae Дисертация на Dipl.-Biol. Márta Kovács Председател на докторската комисия: проф. Д-р Матиас Хан 1-ви репортер: проф. Д-р Regine Hakenbeck 2-ри репортер: проф. Д-р John A. Cullum Дата на научната дискусия: 8 май 2009 г. Kaiserslautern
Настоящата работа беше извършена в катедрата по микробиология на Катедрата по биология в Техническия университет в Кайзерслаутерн под ръководството на проф. Д-р. Реджин Хакенбек направи.
С настоящото потвърждавам, Марта Ковач, че сам съм подготвил настоящата работа. Уверявам ви, че съм използвал само посочените източници и ресурси. Кайзерслаутерн, 17 март 2009 г.
Съдържание Съдържание Страница Съдържание 1 Резюме 5 Съкращения 7 1. Въведение 8 1.1 Streptococcus pneumoniae 8 1.2 Генетичната компетентност и лизис на Streptococcus pneumoniae 10 1.3 Двукомпонентната система CiaRH 13 1.4 Малки некодиращи РНК 16 1.5 Цел на тази работа 22 2. Материал 23 2.1 Бактериални щамове 23 2.2 Плазмиди 25 2.3 Олигонуклеотиди 26 2.4 Хранителна среда 31 2.4.1 Среда CpH8 31 2.4.2 Среда THB 32 2.4.3 D кръвен агар 32 2.4.4 Среда LB 33 2.4.5 Среда 2xTY 33 2.5 Използвани антибиотици 34 3. Методи 35 3.1 Микробиологични методи 35 3.1.1 Документиране на бактериалния растеж 35 3.1.2 Условия на култивиране 35 3.1.3 Запазване на щама 36 3.1.4 Микроскопия 36 3.1.5 Трансформация на Streptococcus pneumoniae 36 3.1.6 Изследване на компетентността на Streptococcus . пневмония 37 3.1.7 Трансформация на ешерихия коли 37 1
Съдържание 4.10 Изследване на ефекта на отделните csrnas върху транслацията на comc 144 5. Дискусия 146 5.1 Регулираните от CiaRH интергенни промотори и техните транскрипти: 146 The csrnas 5.2 Стратегии за намиране на целевите гени csrna 148 5.3 Валидиране на csrna целевите гени in vivo 150 5.4 Взаимодействие на csrnas с mrnas на техните целеви гени 153 5.5 Връзка между CiaRH-асоциираните фенотипи 156 и csrnas 5.6 Подобни ефекти и механизми при други организми 163 5.7 Outlook 165 6. Библиография 167 4
1. Въведението изглежда участва в регулирането на извънклетъчните адхезини и на секретираните фактори на вирулентност (Kreikemeyer et al., 2001). Друга регулаторна РНК е локусът на таза.Този локус е открит чрез анализ на библиотека на транспозона и е забележим за неговия плейотропен ефект върху експресията на екзопротеини. Генът за РНК е дълъг 459 bp, с допълнителен ген, сага, кодиран между позиции 147 до 308 bp. Може обаче да се покаже, че нетранслираната РНК, а не транслираният продукт SagA влияе върху експресията на фактори на вирулентност (Mangold et al., 2004). Третата известна малка РНК е RivX. Изглежда, че тази РНК е продукт за преработка на транскрипта rivrx. Въпреки че в транскрипта има и ORF, беше възможно да се покаже, че РНК, а не протеинът има регулаторен ефект върху регулираните гени. Тази РНК предизвиква положителен ефект върху Mga-регулираните гени, което е важен регулатор на вирулентността (Roberts and Scott, 2007). 21-ви
2. Материал 2.4 Културна среда 2.4.1 CpH8 среда (C среда) за културата на Streptococcus pneumoniae Във всички изследвания, извършени в тази работа, щамовете Streptococcus pneumoniae са отгледани в среда CpH8 (Lacks & Hotchkiss, 1960). Отделните компоненти на тази среда са произведени отделно и само пипетирани заедно, когато е необходимо. Отделните компоненти се съхраняват при 4 ° С с изключване на светлина. Таблица 2.17: Състав на средата CpH8 Компонент Количество [ml] PreC 400 Добавка 13 Глутамин [1 mg/ml] 10 Adams III 10 Пируват 2% 5 Фосфатен буфер 15 Екстракт от дрожди 5% 9 Краен обем 462 Таблица 2.18: Състав на отделните компоненти Компонент Допълнително количество PreC Na ацетат, безводни 1,2 g казаминокиселини 5 g L-триптофан 5 mg L-цистеин 50 mg H 2 O и 1000 ml добавка регулира pH 7,5, автоклав 3 в 1 соли 60 ml глюкоза 20% (w/v) 120 ml захароза 50% (w/v) 6 ml аденозин [2 mg/ml] 120 ml уридин [2 mg/ml] 120 ml автоклавни компоненти поотделно, пипетирайте заедно при стерилни условия Adams III Adams I 160 ml Adams II 40 ml аспарагин 2 g холин хлорид 0, 2 g CaCl2 [0,1 M] 1,6 ml H 2 O и 1000 ml стерилна филтрация и се съхранява с изключване на светлина Фосфатен буфер ph8 KH 2 PO 4 [1 M] 53 ml K 2 HPO 4 [1 M] 947 ml автоклавиране 31
2. Материал 3 в 1 соли Adams I Adams II MgCl 2 x6h 2 O 100 g CaCl 2, безводен 0,5 g MnSO 4 x4h 2 O [0,1 M] 0,2 ml H 2 O и 1000 ml автоклавиране на биотин 0, 5 g никотинова киселина 150 mg пиридоксин HCl 175 mg калциев пантотенат 600 mg тиамин HCl 160 mg рибофлавин 70 mg H 2 O и 1000 ml стерилен филтър и се съхранява при изключване на светлина FeSO 4 x7h 2 O 500 mg CuSO 4 x5h 2 O 500 mg ZnSO 4 x7h 2 O 500 mg MnCl 2 x4h 2 O 200 mg HCl конц. H 2 O 10 ml и 1000 ml стерилна филтрация и съхраняване с изключване на светлина 2.4.2 Среда на Тод-Хюит (THB) Средата на Тод-Хюит е сложна среда, често използвана за пневмококи, която е получена в готовност (Difco, Детройт, САЩ). Средата се приготвя и автоклавира съгласно инструкциите на производителя. Таблица 2.19: Състав на средата на Тод-Хюит Компонент Количество говеждо сърце (вливане на прясна тъкан) 3.1 g пептон 20 g глюкоза 2 g NaCl 2 g натриев карбонат 2.5 g динатриев фосфат 0.4 g 2.4.3 D кръвен агар Като твърда среда за Култура на Streptococcus pneumoniae беше използвана D кръвен агар. За тази цел D-агар се автоклавира и след охлаждане до 48 ° С се добавя дефибринирана овча кръв (Oxoid) до крайна концентрация 3% (v/v). След добавяне на всякакви добавки като антибиотици, сместа се смесва и се излива в стерилни чаши на Петри. 32
2. Материал Таблица 2.20: Състав на D кръвен агар компонент глюкоза бактопептон неопептонов дрожден екстракт NaCl Tris агар H 2 O количество 1 g 10 g 5 g 1,25 g 5 g 1,25 g 15 g до 1000 ml 2.4.4 LB среда Средата Lauria-Bertani (LB) се използва за култивиране на Е. coli (Sambrook et al., 1989). За да се получи LB агар, към средата се добавят 15 g/l агар. При необходимост бяха добавени подходящи антибиотици и други добавки. Таблица 2.21: Състав на LB среда Компонент Количество бактопептон 10 g NaCl 5 g екстракт от дрожди 5 g H 2 O до 1000 ml 2.4.5 2xTY среда Средата 2xTY се използва за изолиране на по-малки количества плазмид от Е. coli. Таблица 2.22: Състав на средата TY Компонент Количество Бактопептон 16 g NaCl 5 g екстракт от дрожди 5 g H 2 O до 1000 ml 33
2. Материал 2.5 Използвани антибиотици Антибиотиците, обобщени в таблица 2.23, се добавят към твърдата и течната среда, както е необходимо. След приготвянето им изходните разтвори се филтрират стерилно и се съхраняват при -20 ° С. Таблица 2.23: Използвани антибиотици Антибиотичен разтворител Концентрация на изходния разтвор Тетрациклин 50% EtOH 3 mg/ml 3 µg/ml Крайна концентрация Ампицилин H 2 O 20 mg/ml 100 µg/ml Спектиномицин H 2 O 20 mg/ml 80 µg/ml Стрептомицин H 2 O 20 mg/ml 200 µg/ml Еритромицин 90% EtOH 1 mg/ml 1 µg/ml Канамицин H 2 O 20 mg/ml 200 µg/ml Хлорамфеникол H 2 O 1 mg/ml 1 µg/ml 34
4. Резултати 1.0 Ефективност на трансформация% 0.8 0.6 0.4 0.2 R6 RK12345 RK123 RK45 R6 ciar: aad9 0.0 0 20 40 60 80 100 120 Клетъчна плътност [NU] Фигура 4.24: Ефективност на трансформация на различни ccn делеционни щамове в сравнение с див тип S. pneumoniae R6 и S. pneumoniae R6 ciar: aad9. Клетъчната плътност в нефело единици е показана на оста X. Ефективността на трансформация в проценти (делът на трансформираните клетки в броя на живите зародиши) е на оста Y. Дивият тип R6 е черен, RK12345 е червен, RK123 е зелен, RK45 е тъмно син и S. pneumoniae R6 ciar: aad9 е показан в светло синьо. Резултатите от изследването на естествената трансформируемост на щамовете RK12345, RK123 и RK45 показват връзка между малките некодиращи РНК и естествената трансформируемост на S. pneumoniae R6. И трите изследвани щама показват намалена трансформируемост. Този фенотип не може да се наблюдава с R6 ciar: aad9. Беше възможно само да се определи промяна в пика на компетентност в посока към по-ниска плътност на клетките. Осемкратното намаляване на трансформируемостта на щама RK12345 противоречи на пълната трансформативност на щама с изтрит циар. 105
4. Резултати 4.7.3 Определяне на β-галактозидазната активност на целевия ген - сливане на LacZ протеини като функция на csrnas Активността на целевия ген - lacz слети протеини като функция на csrnas се определя с помощта на ß-галактозидазни анализи. За тази цел плазмидите се вмъкват в генома на див тип S. pneumoniae R6 и csrna мутант S. pneumoniae RK12345. Активността на β-галактозидазата се измерва, като се използват цялостни клетъчни лизати на съответните щамове. Измерванията бяха извършени в средната експоненциална фаза при клетъчна плътност на Nephelo 80 и малко след влизане в стационарната фаза. Резултатите от измерванията са показани на фигура 4.30. R6 RK12345 20 T3comA 50 40 T3hsdS ß-Gal единици 15 10 5 ß-Gal единици 30 20 10 0 0 exp. Фаза stat. Фаза exp. Фаза stat. Фазови ß-галови единици 80 60 40 20 T3spr1610 ß-галови блокове 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 T3comC 1000 0 годен. Фаза stat. Фаза 0 срока на годност Фаза stat. Фаза 800 700 600 T3spr0081 8000 7000 6000 T3cibB ß-Gal единици 500 400 300 ß-Gal единици 5000 4000 3000 200 2000 100 1000 0 опит. Фаза stat. Фаза 0 срока на годност Фаза stat. Фаза 125
4. Резултати 700 600 T3spr0231 200 180 160 T3blpY ß-Gal единици 500 400 300 200 100 ß-Gal единици 140 120 100 80 60 40 20 0 опит. Фаза stat. Фаза 0 срока на годност Фаза stat. Фазови ß-галови единици 400 350 300 250 200 150 T3spr0822 ß-галови блокове 50 40 30 20 T3spr1932 100 50 10 0 0 годен. Фаза stat. Фаза exp. Фаза stat. Фаза 20 T3spr0265 80 T3spr1645 15 60 ß-Gal единици 10 ß-Gal единици 40 5 20 0 exp. Фаза stat. Фаза 0 срока на годност Фаза stat. Фаза 1000 800 PvegT ß-Gal единици 600 400 R6 RK12345 200 0 exp. Фаза stat. Фаза Фигура 4.30: Активност на β-галактозидаза на 12 клонирани прицелни гени - сливания на lacz протеини в див тип S. pneumoniae R6 и в S. pneumoniae RK12345. Измерванията бяха проведени в два момента от времето: в експоненциалната фаза при клетъчна плътност на Nephelo 80 и малко след навлизане в стационарната фаза. Единиците се определят като nmol освободен ONP/min/mg протеин. Показани са средствата на поне 2 независими експеримента. Дейностите на целевия ген - синтез на lacz протеини в С среда са показани в черно с S. pneumoniae R6 и червено за S. pneumoniae RK12345. Като контрола, промоторната активност на P vegt се определя и в двата щама. 126
4. Резултати Фигура 4.39: Анализи за смяна на лентата и анализ на Northern blot на комплексите за взаимодействие на comc-rna и csrna3. Изображенията по-горе показват геловете за лентово преместване, оцветени в SYBRGreenII. Зареждането с гел е както е описано по-горе. Лентите за взаимодействие са маркирани с червени стрелки. Изображенията по-долу показват попитите гелове. На снимката вляво за откриване е използвана сонда, специфична за csrna3. На дясната снимка мембраната беше изрязана и comcbzw. използвани htra-специфични сонди. Попитите ленти за взаимодействие са маркирани с червени стрелки. Анализ на взаимодействието с spr0081 Анализът на взаимодействието се извършва с всички 5 csrnas. Ясни ленти за взаимодействие могат да бъдат открити в csrna2, csrna3, csrna4 и csrna5. В същото време в тези коловози може да се наблюдава изчезването на spr0081-rna при действителната й височина на ходене. В csrna1 не може да се видят ясни ленти за взаимодействие, а лентата spr0081 също не се променя. По този начин spr0081-rna не образува комплекс за взаимодействие с csrna1. Тук също csrna1 образува ленти с приблизително двойна височина (Фигура 4.40, лента 5). Тези ленти се виждат и в последните следи от отрицателния контрол. 142
5. Дискусия 5. Дискусия 5.1 Регулираните от CiaRH интергенни промотори и техните транскрипти: The csrnas Регулираните от CiaRH интергенни промотори са силно зависими от CiaR. Без функциониращ регулатор на реакцията практически няма израз (Halfmann et al., 2007). Дейностите на тези организатори са показани в таблица 5.1. Таблица 5.1: Активност на β-галактозидаза в резултат на регулираните от CiaRH интергенни промотори Промотори R6 ciar: aad9 R6 (wt) R6 ciaht230p P ccnc