Ключови калциеви сигнали задействат по време на плазмодиевата инвазия на еритроцитите

Теми

Резюме

Въведение

Тук генерираме моноклонални антитела (mAbs) срещу RII-3 еритроцитния свързващ регион на PfRH1 (член на семейството RH на P. falciparum 7). Ние показваме, че PfRH1 mAbs блокират инвазията на мерозоита чрез специфично инхибиране на калциевата сигнализация в паразита, вместо директна намеса в свързването на паразита с еритроцитите. Освен това показваме, че инхибирането на тази калциева сигнализация предотвратява изхвърлянето на EBA175 и по този начин предотвратява образуването на кръстовища (ключова стъпка, която позволява на паразита да навлезе в еритроцитите, използвайки мотор за актин-миозин 3). Нашите резултати показват, че PfRH1 и EBA175 имат различни функции, като PfRH1 има първоначална роля на детектиране и трансдукция на сигнала, което води до последващо освобождаване на EBA175 от микронемата и образуване на кръстовища. Тези нови знания биха могли да помогнат за идентифициране на нови цели за антималарийна намеса.

ключови

Резултати

Специфичните за PfRH1 mAbs инхибират инвазията на мерозоитите

В тази работа ние използваме PfRH1 за изследване на основните вътреклетъчни сигнални събития, водещи до успешна инвазия на еритроцитите. По-рано показахме, че антителата, насочени към свързващия регион на реритроцитите (RII-3) на PfRH1 (фиг. 1а), могат да инхибират мерозоитна инвазия 7. Тук генерирахме четири моноклонални антитела (Acb: C49, C41, C2 и C50) срещу този регион и потвърдихме тяхната специфичност, използвайки Western blot и имунофлуоресцентни анализи. Всички антитела разпознават очакваната 240 и 140 kDa обработена форма на PfRH1 в екстракти от супернатант, мерозоити и шизонти от паразитна култура T994, докато не е открита еквивалентна лента в инактивираща линия T994ARHH1 от PfRH1 (допълнителна фигура S1a - c). Тестовете за имунофлуоресценция показват, че всички mAbs дават частично локализирани точкови мотиви с EBA175 (известен протеин от микронема) в апикалния край на мерозоитите в T994, което съответства на прогнозираното местоположение на PfRH1 (фиг. S1d допълнително). Не се наблюдава оцветяване в T994ΔRH1 (допълнителна фигура S1e), което допълнително потвърждава специфичността на mAbs.

( в ) PfRH1 с пълна дължина, включително сигналната последователност (SS, червено), RII-3 свързващата област на еритроцитите (синя, обхващаща аминокиселини 500-833) и трансмембранния домен (TM, жълт). ( б, срещу ) Анализи за инхибиране на инвазията, използващи mAbs на анти-PfRH1 (IgG) в T994 ( б ) и T994ΔRH1 ( срещу ). Стълбовидните графики показват средна стойност ± wk; n = 3. * P ≤0.0003 от еднопосочна ANOVA, което показва, че C49 е успял да блокира инвазията на T994 в сравнение с инвазията в присъствието на C2 и C50. + P ≤ 0, 0003 от еднопосочен ANOVA, което показва, че C41 значително инхибира инвазията в сравнение със C2 и C50.

Изображение в пълен размер

Инхибиторните mAbs блокират инвазията преди образуването на кръстовища

Изображение в пълен размер

PfRH1 инхибиторните mAbs блокират Ca 2+ сигнализирането по време на инвазия

Изображение в пълен размер

Жизнеспособност на мерозоитите

Изображение в пълен размер

EBA175 инхибитор mAb няма ефект върху Ca 2 сигнализирането+

В съответствие с публикуваните данни, нашите резултати показват, че PfRH1 има пряка роля в освобождаването на Ca 2+, което впоследствие задейства секрецията на микронема и EBA175. Ако това наистина е вярно, може да се очаква, че блокирането на функцията EBA175 и следователно образуването на кръстовища няма да има ефект върху сигнализирането на Ca 2+. За да проучим това по-нататък, използвахме блокиращия нашествието mAb R215, който е насочен към региона EBA175 II (реф. 30). Както беше описано по-рано, mAb R215 е в състояние да блокира инвазията в зависимост от дозата, с максимално инхибиране от приблизително 47,7% ± 1,11 при 0,25 mg ml -1 (Фиг. 5а) 30. Това антитяло обаче няма ефект върху вътреклетъчното сигнализиране на Ca 2+ по време на инвазия (фиг. 5б, допълнителни данни 1-6). Този резултат потвърждава, че антителата срещу инвазия, насочени към EBA175, действат след сигнализиране на Ca 2+, докато тези, насочени към PfRH1, действат преди сигнализирането на Ca 2+ и ясно подчертават различните роли, играни от PfRH1 и EBA175.

( в ) Анализ за инхибиране на инвазията с използване на анти-EBA175 mAb R215 в паразити T994. Стълбовите диаграми показват инхибирането на инвазията на различни концентрации (0,25-0,008 mg ml -1) на специфичния за EBA175 mAb R215 в T994. Стълбовидните графики показват средна стойност ± wk; n = 3. ( б ) Цитозолните нива на Ca 2+ бяха открити с помощта на флуоресцентен четец. T994 мерозоитите, предварително заредени с Fluo-4AM, се инкубират с еритроцити в отсъствие (RBC) или в присъствието на R215 (RBC + R215 (0.2 mg ml -1)). Като положителна контрола се използва Ca 2+ йонофор A23187 (RBC + A23187). Промените в нивата на цитозолен Ca 2+ по време на инвазията на мерозоита са оценени с течение на времето, като се използва флуоресцентен четец на плочи. ≤ΔF (t), отразяващи общите промени в нивата на цитозолен Ca 2+ в мерозоитите, бяха начертани като функция от времето (ите). Експерименталните данни бяха представени като средна стойност ± wk; n = 3.

Изображение в пълен размер

MAbs на инхибитора на PfRH1 блокират експресията на EBA175

Изображение в пълен размер

$ config [ads_text16] не е намерен

Дискусия

В бъдеще сега ще бъде важно допълнително да се определи механизмът, чрез който RH-медиираният сигнал се предава на мерозоита, за да задейства освобождаването на Ca 2+. Като цяло нашите резултати дават нови прозрения за фино регулираната сигнална каскада, която е необходима за осигуряване на успешна инвазия на мерозоита и за откриване на път за анализ на сигналните пътища, участващи в регулираната секреция на апикални органели по време на инвазията. Заедно това ще ни осигури по-добро разбиране на сигналните механизми, важни за инвазията на мерозоитите и как тези процеси могат да бъдат нова цел за намеса при малария.