Клинично приложение и медицинско значение на бактериалната геномика и метагеномика - Преглед
обобщение
Новите технологии за секвениране позволяват бързо и достъпно получаване на геномни последователности за приложения като а) разработване на диагностични PCR или серологични тестове; б) откриване на фактори на вирулентност и гени за резистентност към антибиотици и в) епидемиология на патогенни бактерии. По този начин бактериалната геномика е полезна за микробиолози, специалисти по инфекциозни болести и специалисти по хигиена в болниците. Определянето на микробния състав на пробата, наречено метагеномика, е друго приложение на новите технологии за секвениране. Изучаването на човешката микробиота е полезно за разбиране на въздействието на бактериите върху затлъстяването, астмата или диабета. Метагеномиката вероятно ще се превърне в специализиран диагностичен анализ.
Въведение
Секвенирането, което позволява да се определи последователността на нуклеотидни бази в ДНК, революционизира научните изследвания. През 1977 г. Sanger et al. секвенира първия геном на бактериален вирус (ΦX174) чрез ензимен синтез. 1 Оттогава значителните технически подобрения позволиха появата на нови така наречени технологии за последователност с висока производителност (NTS) (Таблица 1). Тези NTS значително увеличиха скоростта на последователността и едновременно намалиха разходите си. Съвсем наскоро бяха пуснати модели на по-компактни секвенсори като Roche/454 GS Junior, Illumina MiSeq или Ion torrent PGM. 2 По-евтини, но по-малко продуктивни, те въпреки това имат достатъчен капацитет за диагностични бактериологични лаборатории предвид големината на бактериалните геноми (приблизително 1000 пъти по-малки от човешкия геном). Използването на секвенсери с висока производителност доведе до експоненциално увеличение на броя на секвенираните бактериални геноми (Фигура 1). По този начин 98% от 26 000 налични в момента геноми са секвенирани през последните седем години. Наличните данни за микробни общности също нарастват бързо, благодарение на метагеномните подходи.
Сравнителна таблица на различните технологии за последователност с висока производителност
Сравнителна таблица на различните технологии за последователност с висока производителност
Геномика или метагеномика: как да започнем ?
Бактериалната геномика, позволяваща изследването на бактериални геноми (тяхната структура, еволюция, функция на кодираните гени и тяхното регулиране), се основава главно на изолирането и културата на дадена бактерия. Получаването на чиста култура е съществена стъпка в свързването на конкретния фенотип на бактериален щам с неговото генно съдържание, по-специално за конкретно изследване на неговата вирулентност, патогенност или резистентност.
По-голямата част от бактериите (над 99%) обаче не могат да бъдат култивирани. 3 По този начин, за да се изследва бактериалната общност като цяло, вече е възможно да се секвенира ДНК на всички бактерии, присъстващи в дадена среда (почва, вода, храносмилателен тракт на хора и животни, клиники за проби ...). Този подход, наречен "метагеномика", ни разказва за разнообразието и относителното изобилие на присъстващите микроорганизми.
Както е илюстрирано на Фигура 2, секвенирането на пълния геном на бактерия или метагеномното секвениране се извършва в четири основни стъпки: а) екстракция на геномната ДНК, или от чиста бактериална култура, или директно от проба; б) ДНК секвениране със или без предварително усилване; в) сглобяване на биоинформатика на секвенирания геном (и) и г) анализ на получените последователности.
Различните етапи на секвениране на бактериален геном
Приложения на геномиката в клиничната микробиология
Появяват се нови приложения на NTS в медицинската област (Таблица 2), като: разработването на по-ефективни инструменти за молекулярна диагностика, задълбочено изследване на епидемии, изследване на патогенността на бактериален щам, както и от откриване на фактори на вирулентност (вирулома) или гени, кодиращи антибиотична резистентност (резистом). 4,5 NTS подхода позволяват цялостен анализ на въпросния микроорганизъм и в бъдеще ще предоставят тези резултати толкова бързо, колкото конвенционалните методи.
Примери за клинични приложения чрез използването на нови технологии за секвениране (NTS)
Разработване на инструменти за молекулярна диагностика
Разширяването на NTS даде възможност за разработване на инструменти за профилактика и диагностика на бактериални инфекции, включително чувствителни и специфични PCR. 6–8 По този начин Yang et al. разработи широкоспектърен PCR, базиран на геномно сравнение на 27 щама на Acinetobacter baumannii, за да подобри наблюдението на клонални и нововъзникващи патогенни щамове на този бактериален вид. 6 Наскоро идентифицирахме полиморфен щам на менингокок (Neisseria meningitidis), който не беше открит от диагностичната PCR, използвана в CHUV. 9 Сравнението на гените на този щам с тези на 183 други налични щамове на N. meningitidis даде възможност да се идентифицират единадесет целеви гена и да се разработят диагностични PCRs, специфични за вида N. meningitidis. 10