Клетъчни ефекти, механизми на действие и методи за откриване на хормони на щитовидната жлеза и техните

Клетъчни ефекти, механизми на действие и методи за откриване на хормони на щитовидната жлеза и техните метаболити Дисертация за получаване на академична степен rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) По биология, подадена във Факултета по природни науки на Университета Хумболт в Берлин от магистърска наука трофолог Ина Лехмфул Президент Университет Хумболт в Берлин проф. Д-р Ян Хендрик Олберц Декан на Факултета по природни науки проф. Д-р Ричард Луций Рецензент: 1. Проф. Д-р. Вернер Клоас 2. Проф. Д-р Йозеф Кьорле 3. Проф. Д-р Jens Mittag Ден на устния изпит: 23 май 2015 г.

клетъчни

Съдържание Съдържание. I Списък на съкращенията. V Списък на фигурите. X Списък на таблици. XI резюме. XII резюме. XIII 1. Въведение. 1 1.1 Щитовидната жлеза. 1 1.2 Тиреоидни хормони (TH). 1 1.2.1 Биосинтез. 1 1.2.2 Пускане и транспортиране. 3 1.3 Хипоталамусна хипофизна щитовидна ос (HPT). 4 1.4 Метаболизъм на тиреоидния хормон. 4 1.4.1 Метаболизъм на тиреоидния хормон от дейодази. 4 1.4.2 Алтернативен метаболизъм на TH. 6 1.4.3 Локални и системни ефекти на активния TH T 3. 7 1.5 Важни метаболити на TH 3.5 T. 9 2 1.5.1 Локални и системни ефекти на 3.5 T 2. 9 1.5.2 Транспорт в серума и в целевите клетки . 10 1.5.3 TH метаболитни рецептори. 10 1.5.4 Методи за откриване на 3.5 T 2. 11 1.6 Важни метаболити TH 3 T AM. 12 1 1.6.1 Локални и системни ефекти на 3 T 1 AM. 12 1.6.2 Транспорт в серума и в целевата клетка. 13 1.6.3 TH метаболитни рецептори. 13 1.6.4 Методи за откриване на метаболита. 14 1.7 Важно TH Метаболити TA 1 3 Тирооцетна киселина. 14 2. Цел на работата. 17 2.1 Метод за откриване на метаболити на тиреоидни хормони. 17 2.2 Ефект на метаболитите на тиреоидния хормон в модела на клетъчната култура. 17 3. Материал. 18 3.1 Химикали. 18 3.2 Устройства. 18 I.

3.3 Консумативи. 18 3.3.1 Комплекти реактиви. 18 3.3.2 Буфери и разтвори. 19 3.4 Бази данни. 20 3.5 Софтуер. 20 4. Методи. 23 4.1 Молекулярно-биологични методи. 4.1.1 Изолация на РНК с Trizol. 23 4.1.2 синтез на cdna. 23 4.1.3 qpcr. 24 4.1.4 Грундове. 25 4.2 Биохимични методи на протеини. 28 4.2.1 Принцип на Брадфорд. 28 4.2.2 Прилагане на Брадфорд. 28 4.3 Клетъчна култура. 29 4.3.1 Клетъчна линия на миши панкреас MIN6. 29 4.3.2 Човешка хепатоцелуларна клетъчна линия HepG2. 29 4.4 Тестове за цитотоксичност/жизнеспособност на клетките. 29 4.4.1 MTT анализ NADPH зависим тест за клетъчна токсичност. 29 4.4.1 а) Принцип на анализа. 29 4.4.1 б) Изпълнение. 30 4.4.2 Анализ на жизнеспособността на ATP клетки. 30 4.4.2 а) Принцип на анализа. 30 4.4.2 б) Изпълнение. 30 4.5 Клетъчно поемане/свързване на клетъчната повърхност от 3 T 1 AM. 30 4.6 Екстракция на MIN6 клетки за LC MS/MS анализ. 31 4.7 Екстракция на супернатанти на клетъчна култура MIN6 за LC MS/MS анализ. 32 4.8 LC MS/MS параметри. 32 4.8.1 AbSciex 4000 анализ на клетъчни култури клетъчни лизати. 32 4.8.2 AbSciex 6500 анализ на супернатанти на клетъчни култури. 34 4.9 Глюкозо-стимулирана секреция на инсулин (GSIS). 36 4.10 Анализ на специфичния за субстрата енергиен оборот с биоанализатор Seahorse XF. 36 4.10.1 Принцип на измерване. 36 4.10.1 а) Митохондриално дишане. 37 4.10.1 б) Гликолиза/метаболизъм на субстрата. 39 II

Списък на съкращенията C Градуси по Целзий µ микро µg микрограми µl микролитра µm микромолар 2 DG 2 дезоксиглюкоза 3 T 1 AM 3 йодотиронамин AADC ароматен L аминокиселина декарбоксилаза Фиг. Фигура AC аденилат циклаза Adra 2α адренергичен рецептор 2alpha ANO1 аномаина АМО1 amp Аномен Amino Масов индекс BSA говежди серумен албумин cdna комплементарна ДНК CLIA Chemilumineszenez Имуноанализ Ct цикъл на влакната COX Cytochrome C оксидаза DC Декарбоксилаза Dehal Дехалогеназа DEPC Диетилпирокарбонат Dio Deiodase DIT 3,5 Diiodtyrosine DMEM DubelcDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxyDoxDoxyDoxDXyDoxyDoxDXyDoxyDoxDXyDoxDXyDoxDXDXDXDXDXXXD Двойна оксидаза ECAR Скорост на извънклетъчно вкисляване V

EDC ELISA ERK EST FBS FCCP Етил 3 (3 диметиламинопропил) карбодиимид ензимно свързан имуноанализ извънклетъчна регулирана киназа експресирани последователност тагове фетален говежди серум карбонил цианид p трифлуорометоксифенилхидразон ft 3/ft 4 свободен/непротеин свързан T 3/T 4 GPL ff fwd FG GFR f fwd FG GFR f fwd FG GFR f fwd GPL Ff fwd FG GFR f fwd GPL Ff fwd FG GFR f fwd GPL Ff fwd FG GFR f f/T 4 GPL GFR f f/T 4 GPL GFR f f/T 4 GPL ff h H 2 OH 2 O 2 HbA 1 c HPLC HPRT HPT ос HRP icv Ig i.p. Ipro i.v. kda KRBH Lat/LAT LCB LC MS/MS LDL m M mab бързодействаща течна хроматография напред Ускорение анти миши IgG, Fc специфичен и биотинилиран G протеин-свързан рецептор глюкозо-стимулирана инсулинова секреция час вода водороден пероксид гликохемоглобин високоефективна течна хроматография хипоксантин гуанин фосфора хипофизна жлеза вентрицела хипофизна жлеза вентрицела хипофизна жлеза вентрицела хипофизна жлеза вентрифаза хипофизна жлеза вентрицела хипофиза хипофизна жлеза вентрифаза хипофиза жлеза вентрицела хипофиза хипертонична жлеза вентрифаза хипофизна жлеза вентрифаза хипофизна жлеза вентрицела хипертонична хипертония интраперитонеален ипрониазид интравенозен килодалтон Krebs Ringer HEPES буфер L тип аминокиселинен транспортер ниско кръстосан буфер течна хроматография съчетана тандемна масспектрометрия ниска плътност липопротеини милимоларни моноклонални антитела VI

MAPK Mct/MCT мин. MIN6 С MTT mrna n NA NADH NADPH NaN 3 ND NEAA ng NIS nm nm NQ ns Ntcp/NTCP NTI Oatp/OATP OCR ON p pab PAI PB PBS PBST PCR PI3K POAF qpcr Mitogen-активиран бета-карбокситрансформатор карбокситрансформатор карбокситрансформатор карбокситрансформатор карбокситрансформатор карбокситрансформатор линия мишка Cell 3 monoiodo тирозин тетразолиева сол messengerrna нано не анализира никотинамид аденин динуклеотид никотинамид аденин динуклеотид фосфат натриев азид не се засича несъществени амино киселини нанограм натриев йодид симпортер нанометър наномола не количествено не значително Na + taurochlorygenate cotransporting полипептид безводен протонизиране окислително фосфонатен кислород phosphoniferous антитела не-тиреоидните скорост органичен фосфонатен транспортиране буфер над thyroidalphospheinate нощта фосфорна киселина фосфонатен кислород phospholeptic антитяло върху тиреоидните скорост polycono-фосфорна антитяло чрез фосфорна кисели фосфонатен кислород фосфонат фосфат-окислен скорост фосфонат през нощта Физиологичен разтвор Фосфатно буфериран солев разтвор с Tween полимеразна верижна реакция Фосфатидил инозитол 3 киназа следоперативно предсърдно (сърдечно) мъждене количествено в реално време PCR VII

rev RIA RNA rpm rq RQ rt 3 s.c. SD SDS sec SHIP Slc/SLC SULT T 0 T 1 T 2 T 3 T 4 TA TAE TAM TAAR TBG TCA Tg TH TBME TPO TRα TRβ TRE TRH TSH обратен радиоимунологичен анализ Обороти на рибонуклеинова киселина/мин. Дихателен коефициент обратен 3,3,5 трийод L тиронин подкожна щитовидна жлеза натриев додецил сулфат второ проучване на здравето в Померания разтворен носител сулфотрансфераза тиронин 3/3 тиронин 3,5/3,3/3,5 дийодин L тиронин 3.3,5 трийодин L тиронин 3.3.5.5 тетрайодин L тиронин/тироксин thyroacetic киселина трис ацетат EDTA буфер thyronamine следа амин свързан рецептор тироксин свързващ глобулин трикарбоксилна киселина тиреоглобулин тиронин, тироиден хормон, трет-бутил метил етер щитовидната пероксидаза тиреоиден хормон рецептор алфа тиреоиден хормон рецептор 3/бета throid стимулиращ протеин 4 тиротропин освобождаващ хормон 3/бета TH отговорен елемент тиротропин освобождаващ хормон 4/tyroid стимулиращ хормон 4/thyrotrophic хормон 4 хормон 3/бета TH отзивчив протеин Транстиретин VIII

VLDL об.% Липопротеин с много ниска плътност об.% IX

Транспортният механизъм в прицелната клетка е известен и активирането на планарните мембранни рецептори тепърва ще бъде изследвано. 16.

Таблица 2 Често използвани комплекти реагенти Комплект реагенти Абсолютен qpcr SYBR Green Mix Bio Rad Протеин Анализ Концентрат на багрилен реагент CellTiter Glo Luminescent Cell Жизнеспособност Анализ RQ1 RNase без DNAse ImmunoPure MAb изотипиращ комплект Инсулин (мишка) свръхчувствителен ELISA скрипт Select cdna Synthesis Kit Pierce MicroCross Buc Комплект за анализ на протеини PIERCE EZ Link Plus Активирана пероксидаза PIERCE SuperSignal ELISA Femto Максимална чувствителност Субстрат RIA rt 3 Sepharose r Протеин A Slide A Lyzer Диализни касети 2K MWCO ThermoScript Обратна транскриптаза Тризол Производител Abgene (Epsom, Великобритания) Bio Rad Laboratgaga (Мюнхен, P) WI, САЩ) Promega (Madison, WI, USA) Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA) DRG диагностика (Marburg) Bio Rad (Мюнхен) Candor Biosciences (Wangen) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) Thermo Scientific ( Waltham, MA, САЩ) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) ZenTech SA (Белгия) GE Healthcare (Фрайбург) Pierce Chemical Co. (Рокфорд, Илинойс, САЩ) Invitrogen (Karlsruhe) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) 3.4 Бази данни Таблица 4 показва всички използвани системи за управление на данни. 3.5 Софтуер Таблица 5 обобщава софтуера, използван в тази работа. 20-ти