Класическата галактоземия, дефицитът на галактокиназа и дефицитът на биотинидаза са молекулярно генетични и

S KoA. a, R-COOH + ATP + CoA RC

дефицитът

Молекулярно генетично и клинично изследване на класическа галактоземия, дефицит на галактокиназа и дефицит на биотинидаза Докторска дисертация Milánkovics Ilona Semmelweis University Докторска школа по молекулярна медицина Изготвено от: Университет Semmelweis, II. Катедра по педиатрия Ръководител на програмата: д-р Андраш Фалус, професор, доктор на Унгарската академия на науките. Ръководители: д-р Вероника Карцаги, ръководител на отдела, д-р д-р Агнес Шулер, главен лекар, д-р Изпитна комисия: Председател: д-р Ендре Черхати, университетски професор, доктор на Унгарската академия на науките Членове: д-р Чаба Шалай, старши изследовател, доктор на Унгарската академия на науките д-р Естер Карг, научен сътрудник, д-р. Официални съдии: д-р Ева Олах, университетски професор, доктор на Унгарската академия на науките д-р Кароли Рач, университетски преподавател, доктор на Унгарската академия на науките Будапеща, 2010 г.

Съдържание Съдържание Списък на съкращенията 5 1. Въведение 6 2. Преглед на литературата 7 2.1. Вродени метаболитни заболявания 7 2.1.1. Патогенеза и клиника на вродени метаболитни заболявания 7 2.1.2. Основни групи вродени метаболитни заболявания 9 2.1.3. Терапия при вродени метаболитни заболявания 12 2.2. Галактоземия 13 2.2.1. Метаболизъм на галактозата 13 2.2.2. Класическа галактоземия 14 2.2.3. Наследяване на класическа галактоземия 15 2.2.4. Дефицит на галактокиназа 17 2.2.5. Наследяване на галактокиназен дефицит 17 2.2.6. Дефицит на UDP-галактоза-4-епимераза 19 2.2.7. Наследяване на дефицит на UDP-галактоза-4-епимераза 20 2.2.8. Терапия и грижи за галактоземия 21 2.3. Дефицит на биотинидаза 23 2.3.1. Цикъл на биотин 23 2.3.2. Дефицит на биотинидаза 24 2.3.3. Наследяване на дефицит на биотинидаза 25 2.3.4. Терапия и грижи за дефицит на биотинидаза 27 2.4. Масов скрининг на новородени 28 2.4.1. Начало на масовия скрининг на новородени 28 2.4.2. Масов скрининг на новородени в Унгария 29 2.4.3. Неонатален масов скрининг за галактоземия 30 2.4.4. Неонатален масов скрининг на дефицит на биотинидаза 31 2.5. Значение на молекулярно-генетичните изследвания 33 3. Цели 35 4. Методи 37 4.1. Проучени пациенти 37 4.1.1. Класическа галактоземия 37 4.1.2. Дефицит на галактокиназа 37 4.1.3. Допълнителни пациенти, изследвани за високи нива на галактоза 38 2

Списък на съкращенията Списък на съкращенията A: аденин BTD: биотинидаза C: цитозин D1: Duarte-1, вариант на Лос Анджелис D2: Duarte-2, вариант Duarte EDTA: етилендиаминтетраоцетна киселина ELISA: ензимно свързан имуносорбентен анализ G *: класически галактозен алел G: гуанин G-1-P: глюкоза-1-фосфат G-6-P: глюкоза-6-фосфат G-6-PDH: глюкоза-6-фосфат дехидрогеназа GALE: уридил дифосфат галактоза-4-епимераза GALK: галактокиназа GALT: галактоза-1-фосфат уридил трансфераза IVS: вариация на интронната последователност LTFU: дългосрочно проследяване дългосрочно проследяване MIM: Менделево наследство при човек N: нормален алел NADP: никотинамид аденин динуклеотид фосфин неоткрит OD: оптична плътност PABA: пара -аминобензоена киселина PCR: полимеразна верижна реакция 6-PGA: 6-фосфоглюконат 6-PGD: 6-фосфоглюконат дехидрогеназа PKU: фенилкетонурия R-5-P: рибулоза-5-фосфат RFLP: полиморфизъм на дължина на рестрикционен фрагмент STFU: краткосрочен следват- до краткосрочно проследяване Т: тимин UDP-галактоза: уридил дифосфат-галактоза UDP-глюкоза: ури дилдифосфатна глюкоза СЗО: Световна здравна организация 5

Преглед на литературата Домашната честота на класическата галактоземия е 1: 46 000, което съответства на честотата в кавказкото население [Schweitzer-Krantz, 2003; Bosch et al., 2005]. 2.2.3. Наследяване на класическа галактоземия Класическата галактоземия е автозомно рецесивно наследствено моногенно заболяване. Генът GALT, кодиращ ензима галактоза-1-фосфат уридил трансфераза, е разположен на късото рамо на хромозома 9 (9p13), дълъг е приблизително 4,3 kb и съдържа 11 екзона (Фигура 2) (Leslie et al., 1992). Литературата описва повече от 180 мутации, причиняващи класическа галактоземия [Tyfield and Carmichael]. Три от тези мутационни митации (p.q188r, p.k285n и p.n314d) са изключително често срещани в кавказката популация. Общата честота на алелите на трите мутации при пациенти в някои страни достига 80–90% [Tyfield, 2000]. Фигура 2 A: Локализация на гена GALT върху хромозома 9 (източник: www.genecards.org) B: Структура на гена GALT (източник: www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas) C: Структура на гена GALT cdns, локализация на p.q188r, p.k285n и p.n314d мутации на cdns Най-честата мутация при пациенти с класическа галактоземия е мутацията p.q188r (c.563a> g), която присъства в екзон 6, 188 причинява обмен на глутамин/аргинин при кодон (фиг. 2). Алелната честота на мутацията в Западна Европа е 15

Преглед на литературата 2.2.7. Унаследяване на дефицит на UDP-галактоза-4-епимераза Дефицитът на UDP-галактоза-4-епимераза също се наследява по автозомно-рецесивен начин. Генът GALE, кодиращ ензима, е разположен върху късото рамо на хромозома 1 (1p36-p35) [Benn et al., 1979; Lin et al., 1979; Daude et al., 1995], е с дължина приблизително 4 kb и съдържа 11 екзона (Фигура 4). ATG кодонът, кодиращ изходния метионин на ензима, се намира в екзон 2 [Maceratesi et al., 1998]. Към днешна дата в литературата са описани приблизително 20 различни мутации, които причиняват дефицит на UDP-галактоза-4-епимераза [Wohlers et al., 1999; Henderson et al., 2001; Park et al., 2005]. Фигура 4 A: Локализация на гена GALE върху хромозома 1 (източник: www.genecards.org) B: Структура на гена GALE (източник: www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas) C: Структура на гена GALE cdns 20

Преглед на литературата 2.3. Дефицит на биотинидаза 2.3.1. Цикълът на биотина Биотинът е водоразтворим, основен, витамин В-комплекс (витамин Н), който действа като кофактор за четири ензима карбоксилаза в човешкото тяло [Thoma, 1954; Pispa, 1965]. При нормална диета в тялото ни влиза само минимално количество биотин. Въпреки че някои храни (черен дроб, бъбреци, брашно, соево брашно, яйчен жълтък, мая) съдържат по-големи количества витамин Н, по-голямата консумация на тези не покрива и човешките нужди. За да може биотинът да присъства в правилната концентрация в нашето тяло, е необходим биотинов цикъл, който позволява молекулата да се използва многократно (Фигура 5). Фигура 5. Цикълът на биотина Биотинът навлиза в телата ни чрез храна в свързана с протеини или в свободна форма. Карбоксилната група на молекулата е ковалентно свързана чрез амидна връзка с ензима холокарбоксилаза синтетаза (EC 6.3.4.10.)

Преглед на литературата 2.3.4. Терапия и грижи за дефицит на биотинидаза Дефицитът на биотинидаза се лекува чрез заместване на биотин. Ранната диагностика (вж. Точка 4.5) и ранното започване на лечението са изключително важни, за да се избегнат необратими увреждания като загуба на слуха, зрително увреждане или умствена изостаналост. Фармакологичната доза е 5-20 mg биотин на ден, в зависимост от тежестта на симптомите. Терапията често премахва обратимите симптоми на болестта по много зрелищен начин в рамките на няколко седмици [Mock et al., 1985; Swick and Kien, 1985] (Фиг. 7). Фигура 7. Ефект от терапията с биотин при деца с дефицит на биотинидаза A: След 15 дни заместване с биотин тежките кожни симптоми се подобряват значително (източник: Mock et al., 1985) B: след шест месеца терапия с биотин симптомите на алопеция напълно изчезват (източник: Swick и Kien, 1985) 27

Методология за преглед на литературата [Knappe et al., 1963], Heard et al. е разработен допълнително в метод за масов скрининг, позволяващ диагностицирането на дефицит на биотинидаза на няколко дни [Heard et al., 1984]. Масовият скрининг на дефицит на биотинидаза в Унгария започна през 1989 г. по инициатива на тогавашния генерален директор на Националния институт за здраве на бебетата и децата, проф. Д-р Dezs De Schuler. Министерството на здравеопазването е направило масов скрининг на новороденото задължителен на национално ниво и в двата скринингови центъра [Havass, 1991]. Скринингът за дефицит на биотинидаза се споделя подобно на галактоземията. От 51-те държави-членки в Съединените щати 47 имат задължително задължителен скрининг за новородена маса [Therrell and Adams, 2007]. В Европа скринингът е въведен в шест държави: Швеция, Германия, Швейцария, Лихтенщайн, Австрия и Унгария. Още четири държави: Испания, Белгия, Италия и Турция са или в експериментална фаза на настройка на скрининг, или изследват само определени диапазони (Фигура 10.Б) [Loeber, 2007]. Фигура 10. Скрининг за галактоземия (A) и дефицит на биотинидаза (B) в Европа (въз основа на статистиката от 2004 г .; Loeber, 2007) 32