Изследвания за разпределението на имунните клетки в периферната кръв при затлъстяване, предизвикано от диета
1 От Института по анатомия и клетъчна биология на Медицинския факултет на Университета Мартин Лутер Хале-Витенберг Директор: проф. Д-р. мед. Heike Kielstein Изследвания за разпределението на имунните клетки в периферната кръв в модел на затлъстяване, предизвикан от диета след индукция на тумор Дисертация за придобиване на академична степен на доктор по медицина (д-р мед.), Представена на Медицинския факултет на университета Мартин Лутър Хале-Витенберг от Дорле Кнауф роден на Фрайберг (Саксония) Рецензент: 1. проф. д-р мед. Heike Kielstein 2nd PD Dr. мед. Ханс-Юрген Сейфарт (Лайпциг) 3. Проф. Д-р. мед. Торалф Ланге (Вайсенфес)
5 показват белодробни метастази при затлъстели животни. Тези първоначално откриваеми числени ограничения на NK клетките и моноцитите също могат да бъдат отговорни за факта, че заселването на клетките MADB106 в белите дробове и по този начин образуването на белодробни метастази при затлъстели животни е възможно предимно и напредва по-бързо.
7 Съдържание I Съдържание Страница 1. Въведение Затлъстяване Мастна тъкан Влияние на адипокини върху имунни клетки Свързани със затлъстяването туморни заболявания Цел Материал и методи Тестови животни и животновъдство Експериментална настройка Туморен модел Инжектиране на клетки MADB106 или NaCl Получаване и анализ на пробния материал Екстракция на кръв и органи Липидна екстракция и определяне на концентрацията Имунологични тестове Изолация на PBMC и лизис на еритроцити съгласно Schwinzer Определяне на PBMC номера с използване на камера за преброяване на Нойбауер Оцветяване на специфични имунни клетки с използване на флуорохром-свързани антитела Поточни цитометрични измервания с използване на FACS оценка FACS Количествено определяне на NK клетки, туморни клетки и NK клетъчно-туморни клетъчни контакти или повърхностни метастази в повърхностните метастази Белодробна тъкан Определяне на относителните концентрации на мрна в тъканта на далака при плъхове с нормално тегло или затлъстяване F344, използвайки PCR статистика в реално време 26
8 Съдържание II 3. Резултати Развитие на теглото на тестваните животни Краткосрочен експеримент Дългосрочен експеримент Концентрации на триглицериди и холестерол в черния дроб Флуорезен активиран клетъчен сортер (FACS) - измервания в краткосрочния експеримент NK клетки B лимфоцити T лимфоцити Цитотоксични (CD8 +) T -Клетки T-хелперни клетки (CD4 +) моноцити Fluorezens активиран клетъчен сортер (FACS) - измервания в дългосрочен експеримент NK клетки B-лимфоцити T-лимфоцити Цитотоксични (CD8 +) T-клетки T-хелперни клетки (CD4 +) моноцити количествено определяне на NK клетки MADB106 клетки и NK клетъчно-туморни клетъчни взаимодействия, както и повърхностни белодробни метастази Относителна концентрация на mrna на активиращи и инхибиращи NK клетъчни рецептори и на NK клетъчно специфични цитокини в тъканта на далака Относителна концентрация на mrna в краткосрочен експеримент Относителна mrna- Концентрации в дългосрочни експерименти Резюме на дискусията Библиография 58
9 Съдържание III 7. Тези 68 Декларация за независимост Декларация за предишни докторски опити Таблична автобиография Благодарности
10 Списък на съкращенията IV Списък на съкращенията ANOVA APC BMI CD CFSE CRP DIO FACS FITC IFNγ IL i.v. JAK-STAT KIR MALT MCP-1 MHC MP-NK клетки mrna Ms IgM/G NaCl NKG2D NK клетки PBS PBMC PCR PE Анализ на вариацията Алофикоцианин Индекс на телесна маса Клъстер за диференциация Карбоксифлуоресцеин сукцинимидилов естер С-реактивен протеин Диета-индуцирана диета-индуцирана диета Активирано клетъчно сортиране Флуоресцеин изотиоцианат Интерферон Гама Интерлевкин интравенозно Янускиназа - Преобразуватели на сигнали и активатори на транскрипция Клетка-убиец Имуноглобулиноподобни рецептори Мукоза асоциирана лимфоидна тъкан Моноцити Хемотактичен протеин-1 Основен хистосъвместим комплекс М-моргинален-коммулативен марганин-интегриращ маргинално-коммулативен марган-мулти-иммуномогилиращ комплекс-маргинален мулти-иммуномогилиращ комплекс-маргинален иммуномогилиращ комплекс-маргинален мулти-иммуниращ комплекс-маргинален интегриращ комплекс-маргинал-иммунологичен комбиниран марганин-интегриращ маргинален мулти-иммуномобилизиращ комплекс-маргинален мулти-иммунологичен интегриращ комплекс-Марганин-интегриращ марганин Killer Group 2, член D Естествени клетки-убийци Буфериран с фосфат физиологичен разтвор Периферна кръв Мононуклеарни клетъчни полимеразни верижни реакции Фикоеритрин
11 Списък на съкращенията V PE-Cy7 Phycoerithrin-Cyanin 7 PPARγ RPMI Medium SEM Peroxysome Proliferator Activate Receptor-Gamma Roswell Park Memorial Institute Medium Стандартна грешка на средните T H1/2 T помощни клетки 1/2 T Reg TNFα WHO T регулаторни клетки тумор -Некротичен фактор Алфа Световната здравна организация
32 Тълкуване на материали и методи 21. И накрая, определените свойства на клетките бяха представени под формата на хистограма или графична точка. По този начин повече от десет хиляди клетки могат да бъдат разпределени към определена популация или субпопулация за по-малко от минута. Фиг. 5: Схематично представяне на метода на поточната цитометрия. С помощта на специални лещи клетките се анализират с помощта на разпръсната светлина напред (FSC разсейване напред) и странично разпръсната светлина (SSC разсейване страна). Огледалата бяха използвани за подравняване на светлинните сигнали, така че те в крайна сметка да бъдат уловени от детектори и преобразувани в сигнали на електрическо напрежение Оценка FACS Използвайки поточни цитометрични измервания, В и Т клетки, NK клетки и моноцити бяха изследвани по диференциран начин (Фиг. 6, 7). Фиг. 6: Анализирани В-, Т-клетъчни популации и моноцити Фиг. 7: Анализирани популации на NK-клетки
34 Материал и методи 23 цитотоксични Т клетки Фигура 10: Представителен точков график на оцветяване на цитотоксичните Т клетки или Т-помощни клетки; цитотоксични Т клетки (CD8a PE +, CD4 PE-Cy7 -) в горния ляв квадрант; Т помощни клетки (CD8a PE -, CD4 PE-Cy7 +) в долния десен квадрант. Фигура 11: Представителен точков график на оцветяване на моноцити; Моноцити (CD4 PE-Cy7 +, CD3 APC -) NK клетки, а не NK клетки Фигура 12: Представителен точков график на оцветяване на NK клетки; NK клетки [CD161a ярки (CD161a PE +, CD3 APC -)] в горния ляв квадрант, не-nk клетки [CD161a затъмнени (CD161a PE +, CD3 APC -)] в долния ляв квадрант. Фигура 13: CD161a PE порта, минимуми при 10 4.1 за NK клетки (CD3 -/CD161a ярки) и 10 2.2 за не-nk клетки (CD3 -/CD161a dim)
37 Статистика на материалите и методите Статистическата оценка е извършена с помощта на софтуера GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA). Данните бяха оценени с помощта на еднопосочен дисперсионен тест (ANOVA) и последващ тест за множество сравнения на Tukey. За да може да се определят общите ефекти на диетата и туморните клетки независимо от другия фактор, беше извършен двупосочен ANOVA тест с последващ тест на Bonferroni. Ограничението на значимостта и за двата теста се основава на вероятност за грешка от най-много 5% (P 0,05).
38 Резултати Резултати 3.1 Развитие на теглото на тестваните животни Краткосрочен тест Средното телесно тегло на тестваните животни в началото на теста беше 183,54 g в контролната група и 183,76 g в групата DIO. Плъховете, които са получавали нормокалорична контролна диета за период от шест седмици, са увеличили средното си тегло с 58% до 290 ± 2,6 g през това време. За разлика от тях, животните, които са получавали висококалорична диета DIO, са увеличили телесното си тегло с 65,5% до средно 304 ± 3,9 g (Таблица 3). По време на инжектирането на туморни клетки или носител на NaCl, хранените с DIO животни са постигнали значително по-високо телесно тегло в сравнение с животните, които са получавали контролната диета (P = 0,006), (фиг. 16). Таблица 3: Развитие на теглото на контролните и DIO плъхове в краткосрочния експеримент седмици след началото на диетата Развитие на теглото 183,54 ± 1,5 212,37 ± 1,6 238,13 ± 2,3 255,2 ± 2,34 268, 34 ± 2,4 284,16 ± 2,75 290,24 ± 2,62 контрол [g] развитие на теглото DIO [g] 183,76 ± 1,6 227,18 ± 1,79 251,02 ± 2,61 271 .05 ± 2.79 283.24 ± 3.46 297.47 ± 3.8 304.11 ± 3.88 Показани са средните стойности и съответната стандартна грешка (± SEM); п = 8 плъхове/група
40 Резултати 29 Раздел 4: Развитие на теглото на контролните и DIO плъхове в дългосрочния експеримент седмици след началото на диетата Контрол на развитието на теглото [g] 195,53 ± 1,81 222,59 ± 2,17 245,93 ± 2,46 259, 45 ± 2,81 271,8 ± 2,88 284,29 ± 3,08 294,75 ± 3,02 Развитие на теглото DIO [g] 195,53 ± 2,07 227,28 ± 2,47 253,74 ± 3, 33 269,09 ± 3,68 277,51 ± 4,51 294,16 ± 4,14 304,78 ± 4,43 седмици след началото на диетата Контрол на наддаването на тегло [g] 302,76 ± 3,48 310,51 ± 3, 68 318.04 ± 3.66 329.58 ± 4.09 328.73 ± 4.38 332.49 ± 4.75 332.9 ± 5.47 Развитие на теглото DIO [g] 312.69 ± 4.98 327, 54 ± 5,90 336,25 ± 6,66 351,76 ± 7,21 352,66 ± 7,34 355,67 ± 7,31 367,84 ± 9,19 Показани са средните стойности ± SEM; п = 8 плъхове/група. Прекъснатата линия при прехода от 10-та до 11-та седмица след началото на експеримента илюстрира момента във времето на инжектиране на клетките MADB106 или NaCl.
41 Резултати 30 Телесно тегло в g * * * * * * * DIO контрол i.v. инжекция седмици след началото на диетата Фиг. 17: Развитие на теглото след 13 седмици хранене с контролна диета и DIO диета. Показани са средните стойности на теглото на всички опитни животни (n = 8), ± SEM. Интравенозното инжектиране на туморните клетки или носителя (NaCl) се извършва след 10 седмици. Времената, в които теглата на групата DIO се различават значително от тези на контролната група, са отбелязани със *. 3.2 Концентрации на триглицериди и холестерол в черния дроб Концентрациите на триглицериди и холестерол в черния дроб също са значително по-високи при плъховете DIO в сравнение с контролните животни (табл. 5). Таблица 5: Телесно тегло, концентрация на триглицериди и холестерол в черния дроб при контролни и DIO животни при краткосрочни и дългосрочни експерименти Краткосрочен експеримент Дългосрочен експеримент MADB106 инжекция MADB106 инжекция 21 дни след инжекция MADB106 TG в черния дроб ж) Контрол 38 ± 8 38 ± 4 DIO 90 ± 15 * 65 ± 9 * Холестерол в черния дроб (µmol/g) Контрол 6.7 ± ± 0.3 DIO 11.0 ± 1.6 * 9.3 ± 0.8 * показано са средните стойности ± SEM; п = 8 плъхове/група; значими стойности, обозначени със *, P 0,05; TG = триглицериди
42 Резултати от FACS - измервания в краткосрочен експеримент NK клетки Оценката на броя на NK клетките след кратко излагане на тумора в продължение на 15 минути показва значителни разлики между контролните и DIO животни. Плъховете, хранени с DIO, са имали значително по-малко NK клетки от контролните животни (показани като% от PBMC) от контролните животни (4.3 ± 0.07 срещу 3.95 ± 0.38 (SEM)% PBMC, фиг. 18). NK клетки (% от PBMCs) KoNaCl KoMADB106 * DIONaCl DIOMADB106 Фигура 18: Количествена оценка на броя на NK клетките при мъжки плъхове F344, хранени с диета, индуцирано затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и 15 минути след MADB106- Инжектиране на туморни клетки (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; значителни разлики между контролната и DIO групите са отбелязани като *, P 0,05; PBMC = Мононуклеарни клетки от периферна кръв.
43 Резултати В-лимфоцити След кратка стимулация на туморни клетки в продължение на 15 минути, сравнението на броя на В-лимфоцитите не разкри значителни разлики между отделните групи (Фиг. 19). B лимфоцити (% от PBMCs) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 19: Количествена оценка на B лимфоцитите при мъжки плъхове F344, хранени с диета, предизвикано от затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и 15 минути след MADB106 туморни клетки -Инжектиране (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Т-лимфоцити на мононуклеарни клетки от периферна кръв След кратка стимулация на туморни клетки от 15 минути, сравнението на броя на Т-лимфоцитните клетки не разкрива значителни разлики между отделните групи (ФИГ. 20). Т лимфоцити (% от PBMCs) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 20: Количествена оценка на Т лимфоцити при мъжки плъхове F344, хранени с диета, предизвикано от затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и 15 минути след MADB106 туморни клетки -Инжектиране (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Мононуклеарни клетки от периферна кръв.
44 Резултати Цитотоксични (CD8 +) Т клетки След кратка стимулация на туморни клетки от 15 минути, няма значителни разлики в броя на цитотоксичните (CD8 +) Т клетки между отделните групи (Фиг. 21). 45 Цитотоксични Т клетки (% от Т лимфоцитите) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 21: Количествена оценка на цитотоксичните Т клетки (CD8 +) при мъжки плъхове F344, хранени с диета, индуцирано затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko ) и 15 минути след инжектиране на туморни клетки MADB106 (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Т-помощни клетки на мононуклеарни клетки от периферна кръв (CD4 +) Няма значителни разлики между отделните групи при сравняване на броя на Т-помощните клетки (CD4 + Т-лимфоцити) след кратка стимулация на туморни клетки от 15 минути (фиг. 22 ). 75 Т помощни клетки (% от Т лимфоцити) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 22: Количествена оценка на Т помощни клетки (CD4 +) при мъжки плъхове F344, хранени с диета, предизвикано от затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и 15 минути след инжектиране на туморни клетки MADB106 (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Мононуклеарни клетки от периферна кръв.
45 Резултати Моноцити Има значителни разлики при сравняване на броя на моноцитните клетки на контролни животни с нормално тегло и затлъстяване, които са инжектирани с NaCl. В сравнение с контролните животни със затлъстяване, контролните животни с нормално тегло са имали значително по-голям брой моноцити въз основа на PBMCs в периферната кръв. Сравнението на туморните животни с нормално тегло и затлъстяването и сравнението на DIO и контролните групи не разкриха значими разлики (Фиг. 23). Моноцити (% от PBMCs) KoNaCl * DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 23: Количествена оценка на моноцити при мъжки плъхове F344, хранени с диета, индуцирано затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и 15 минути след инжектиране на туморни клетки MADB106 ( MADB106) или NaCl (п = 8); показани са средните стойности ± SEM; значителни разлики между групите, обозначени със *, P 0,05; PBMC = Мононуклеарни клетки от периферна кръв.
46 Резултати от FACS - измервания в дългосрочен експеримент NK клетки При сравняване на процента на NK клетки в PBMCs три седмици след инжектирането на MADB106, няма значителни разлики между отделните групи (Фиг. 24). 4 NK клетки% от PBMCs KoNaCl KoMADB106 DIONaCl DIOMADB106 Фигура 24: Количествена оценка на броя на NK клетките при мъжки плъхове F344, хранени с диета, индуцирано затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и три седмици след MADB106 брой туморни клетки Инжектиране (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Мононуклеарни клетъчни В-лимфоцити на периферна кръв Дори три седмици след инжектиране на клетки MADB106, оценката на броя на В-лимфоцитните клетки не разкрива значими разлики между отделните групи (Фиг. 25). B лимфоцити (% от PBMCs) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 25: Количествена оценка на B лимфоцитите при мъжки плъхове F344, хранени с диета, предизвикано от затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и три седмици след MADB106 туморни клетки -Инжектиране (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Мононуклеарни клетки от периферна кръв.
47 Резултати Т-лимфоцити Три седмици след инжектирането на туморните клетки, няма значителни разлики между отделните групи по отношение на процента на Т-лимфоцитите в PBMCs (Фиг. 26). Т лимфоцити (% от PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 26: Количествена оценка на Т лимфоцити при мъжки плъхове F344, хранени с диета, предизвикано от затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и три седмици след MADB106 туморни клетки -Инжектиране (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Мононуклеарни клетъчни клетки от периферна кръв (CD8 +) Т клетки Оценката на броя на клетките на цитотоксични (CD8 +) Т клетки след 3 седмици туморен растеж не разкри значителни разлики между отделните групи (фиг. 27). 45 Цитотоксични Т-клетки (% от Т-лимфоцитите) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 27: Количествена оценка на цитотоксичните Т-клетки (CD8 +) при мъжки плъхове F344, хранени с диета, индуцирано затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko ) и три седмици след инжектиране на туморни клетки MADB106 (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Мононуклеарни клетки от периферна кръв.
48 Резултати Т хелперни клетки (CD4 +) Сравнението на броя на клетките на Т хелперни клетки (CD4 +) след 3 седмици туморен растеж не разкрива значими разлики между отделните групи (фиг. 28). 70 Т-хелперни клетки (% от Т-лимфоцитите) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 28: Количествена оценка на Т-хелперни клетки (CD4 +) при мъжки плъхове F344, хранени с диета, предизвикано от затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и три седмици след инжектиране на туморни клетки MADB106 (MADB106) или NaCl (n = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Мононуклеарни моноцити на периферна кръв След 3 седмици растеж на тумора, сравнението на броя на моноцитите не разкри значителни разлики между отделните групи (Фиг. 29). Моноцити (% от PBMCs) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Фигура 29: Количествена оценка на моноцити при мъжки плъхове F344, хранени с диета, индуцирано затлъстяване (DIO) или контролна диета (Ko) и три седмици след инжектиране на туморни клетки MADB106 (MADB106 ) или NaCl (п = 8); показани са средните стойности ± SEM; PBMC = Мононуклеарни клетки от периферна кръв.