Изследвания на антиоксидантната ефективност на полифенолните съставки на ябълков сок в
Проучвания върху антиоксидантната ефективност на съставките на полифенолни ябълкови сокове в човешките клетки на дебелото черво Дисертация, одобрена от катедрата по химия на Техническия университет в Кайзерслаутерн за присъждане на академична степен Доктор по естествени науки (D386), представена от дипломиран химик по храните Сандра Шефер Кайзерслаутерн, 2006
Настоящата работа е създадена между юни 2002 г. и ноември 2005 г. в отдела по химия, химия на храните и токсикология на околната среда в Техническия университет в Кайзерслаутерн. Ден на научната дискусия: 25 април 2006 г. Изпитна комисия Председател: проф. Д-р Х. Сицман 1-ви репортер: проф. Д-р Г. Айзенбранд 2-ри докладчик: проф. Д-р Д-р Д. Шренк Благодаря на проф. Д-р. Г. Айзенбранд и д-р C. Janzowski за предоставяне на темата и за предложения и добронамерена подкрепа по време на докторския период.
Съдържание 5.5.2.1 Добавяне на аскорбинова киселина. 152 5.5.7.1 Зависимост и обратимост на рН. 154 5.5.8 РЕЗЮМЕ НА СТАБИЛНОСТТА НА ПЛИФЕНЛИТЕ 157 6 ДИСКУСИНА И ПЕРСПЕКТИВИ. 158 7 РЕЗЮМЕ. 168 8 СПИСЪК НА ЛИТЕРАТУРАТА. 170 9 ПРИЛОЖЕНИЕ. I 9.1. ИЛЮСТРАЦИИ, НЕ ПОКАЗАНИ. I 9.2 CV. V 9.3 ПРЕДСТАВЯНЕ И ПУБЛИКАЦИИ НА PSTER. VI
Списък на съкращенията ph pk a PKA PKC PKZ Plt Plz Que, QQ - Qq ra (p) e RS RP RT Rut SD SE SGLT1 SD SRB SSA SSB SULT TAC TBARS TEAC TCA TEA tgsh TI% TNB TRAP Tris UDPGT UDP VdF Логаритъм на концентрация на водородни йони Константа на киселинна дисоциация протеин киназа А протеин киназа С първични (човешки) клетки на дебелото черво флоретин флоридин кверцетин кверцетин-о-семихинон кверцетинхинон възстановени смеси от ябълков сок (помак) екстракти реактивен кислород, англ. за реактивни кислородни видове време на задържане на обърната фаза рутин стандартно отклонение за стандартно отклонение стандартна грешка за стандартна грешка зависим от натрий глюкозен транспортер супероксид дисмутаза сулфорозамин В сулфосалицилова киселина едноверижно прекъсване, англ. за едноверижно прекъсване фенол сулфат трансфераза общ антиоксидант капацитет реактивни вещества тиобарбитурова киселина Тролокс еквивалентен антиоксидант капацитет трихлороцетна киселина триетаноламин общ глутатион Интензитет на опашката, англ. за интензивност на опашката 5-тио-2-нитробензоат общ пероксилен радикал потенциал за улавяне на трис (хидроксиметил) аминоетан UDP-глюкуронил трансфераза урацил дифосфат асоциация на германската индустрия на плодови сокове e.v.
Теоретичните основи могат да бъдат предотвратени чрез подходяща диета и начин на живот [Donaldson, 2004]. Молекулни механизми на канцерогенезата на дебелото черво Канцерогенезата е многоетапен процес, който включва молекулярни и клетъчни промени. Процесът може да бъде разделен на три свързани етапа: Иницииране на тумор, промоция, прогресия (Фигура 3.3). I N I T I A T I N P R M T I N нормална клетъчна мутация на гени, регулиращи растежа: APC, K-ras и др. инициирана селекция на клетки растеж на инициирани клетки анормална криптова фокус мутация, делеция DCC, p53 причинява ендогенен FAP, HNPCC генотокс. Суб. Вируси RS Медиатори на възпаление Увреждане на тъканите, CU, MC Adenoma P R G R E S S I N Селекция Карцином Инвазия Метастази Фигура 3.3: Многоетапен процес на развитие на рак на дебелото черво, модифициран от [Schulte-Hermann et al., 2004]; Съкращения: APC: аденоматозна полипоза коли; FAP: фамилен аденоматозен полипозен синдром; HNPCC: синдром на неполипозен колоректален рак; CU: улцерозен колит; MC: болест на Crohn; DCC: изтрит при рак на дебелото черво 9
Теоретични принципи При висока консумация на протеини има повишен трансфер на протеини, пептиди и урея в дебелото черво. Освен всичко друго, бактериалният метаболизъм произвежда амониевия катион (NH + 4). Това е цитотоксично при опити с животни и може да играе роля в канцерогенезата. [Biesalski, 1999] 12
Теоретични основи NADP + NADPH FAD червен FAD оксид липидна пероксидация хинон семихинон радикал окислително-редукционен цикличен ензим инактивация H Haber-Weiss реакция 2 ДНК увреждане Fe Fenton реакция Fe 2 - H 2 2 SD 2 2 CAT GSH NADP + GPx GSR H 2 GSSG NADPH Фигура 3.4: Примери за развитието на различни RS, защитни механизми и увреждания (зелено: детоксикация, червено: преки последици от реакции на RS; модифицирано от [Kelly et al., 1998, Sies, 1985]; CAT: каталаза, GSH: намален глутатион, GSSG: оксидиран глутатион, GPx: глутатион пероксидаза, GSR: глутатион редуктаза, SD: супероксид дисмутаза, CYP: цитохром P450-зависими монооксигенази Хидроксилният радикал Н действа като най-реактивните кислородни видове [Sies, 1991] със стандартен потенциал за редукция от 2,31 V силно окисляващ [ Halliwell and Gutteridge, 1999]. Н може да възникне в много биологично значими системи, например чрез катализирана с тежки метали реакция на Хабер-Вайс (напр. С мед или желязо, - уравнение 3.7) от 2 и Н2 2. Частичната реакция, катализирана с желязо-йон, е известна също като реакция на Фентън (ур. 3.6) [Айзенбранд и Мецлер, 2005]. 2 - + Fe 3+ 2 + Fe 2+ (3.5) Fe 2+ + H 2 2 H + H - + Fe 3+ (3.6) 2 - + H2 2 H + H - + 2 (3.7) 14
Теоретични основи 3.3. Оксидативен стрес и неговите последици 3.3.1 Липидна пероксидация (LP) Важната роля на липидите в клетъчните компоненти подчертава значението на възможното им увреждане от окисляването в биологичните системи. Тази реакция на окисление, известна също като LP верижна реакция, е разделена на три фази: иницииране, разпространение, прекратяване и е показана схематично на Фигура 3.5. LH R RH Иницииране LH L 2 LH Удължение на веригата L X Прекратяване стабилен продукт Фигура 3.5: Преглед на LP, съгласно [Kelly et al., 1998]; LH: мастна киселина; R: реактивни видове; X: молекула, с която L реагира. Верижната реакция започва от реактивни видове, които могат да абстрахират водороден атом от метиленова група (иницииране). Н стартира верижни реакции с всички мастни киселини, докато 2 реагира само с някои особено активирани мастни киселини [Halliwell and Gutteridge, 1999]. Това създава алкилни и пероксилни радикали, които след това реагират с други мастни киселини. Радикалната верижна реакция се разклонява чрез разлагането на пероксиди, от които възникват два радикала (разпространение). Прекъсване на веригата се получава, когато радикалите реагират с молекули, които образуват стабилни продукти (терминация). [Belitz et al., 2001, Kelly et al., 1998] 17
Теоретични основи Идеалните субстрати за LP са полиненаситени мастни киселини с бисалични метиленови групи. При тези позиции въглерод-водородните връзки имат ниски енергии на дисоциация, така че абсорбирането на водород чрез радикални реакции е лесно възможно. [Kelly et al., 1998] Прекисното окисляване на липидите и свързаната с него фрагментация водят до голямо разнообразие от наситени и ненаситени молекули, напр. Алкани, алдехиди, кетони и фурани [Belitz et al., 2001]. В допълнение към свойствата на ароматни компоненти, тези реактивни молекули могат да имат и цитотоксични, генотоксични и мутагенни ефекти [Marnett, 1999]. Образуването на малондиалдехид (MDA) трябва да бъде обяснено като пример за LP продукт: R 2, 2 RH CCH 3 удължаване на веригата CCH 3 циклизация CCH 3 2, RH R CCH 3 H топлина, H + CCH 3 фрагментация малондиалдехид + H CCH 3 Фигура 3.6: Образуване на малондиалдехид (MDA) от α-линоленова киселина, съгласно [Belitz et al., 2001] MDA се образува от полиненаситени мастни киселини чрез реакция с пероксилен радикал, кислород, последваща циклизация и фрагментация (Фигура 18
Теоретични принципи NH 2 NH 2 HN NHNNNNNH 2 NNHHNNHNNH 8-хидроксигуанин 2-хидроксиаденин 8-ксиаденин HN NH CH 3 HHH HN NHHHNH 2 HN HNN NH 2 CH тимин гликол 5- (хидроксиметил) урацил 2,6-диамино-4-хидрокси- 5-формамидопиридин Фигура 3.7: Примери за окислени пиримидини и пурини, съгласно [Meneghini, 1997]. Атаката на D може да доведе до различни продукти, напр. Окисление на гуанина в 4, 5 или 8 позиция (8-ксо-дезоксигуанин или 8-хидроксидезоксигуанин, 8-H-dG) на пуриновия пръстен, което води до отворени на пръстен продукти като 2,6-диамино-4-хидрокси-5-формамидопиримидин ( FaPy) продължават да реагират (Фигура 3.8). Атаката срещу пиримидини също може да доведе до основни димери. [Halliwell and Gutteridge, 1999, Jaruga and Dizdaroglu, 1996, Kelly et al., 1998] HN NH 2 NNNR дезоксигуанин ксидация H редукция NH 2 HN NNNR пръстен, отварящ NH 2 HN NNNRHH 8 HG NH 2 HN NCNNRHH + e -, + H + + e -, + H + + e -, + H + NH 2 HN NN NH R Отваряне на пръстена NH 2 HN NNNRHHNH 2 HN NNNRH FaPy 8-H-dG Фигура 3.8: Модификации на дезоксигуанин от Н радикали, съгласно [Halliwell and Gutteridge, 1999] 20
Теоретични принципи за възстановяване на ДНК Системите за възстановяване на ДНК разпознават модифицирани и несъответстващи бази на ДНК. Такива модификации са основно окислени основи [Christmann et al., 2003]. Когато повредената основа бъде разпозната и изрязана от ДНК гликозилазата, се създават така наречените сайтове на апурин/апиримидин (AP) и се задейства ремонтната каскада за възстановяване на базата (BER), най-важната система за възстановяване на окислителните увреждания на ДНК ( Фигура 3.11). ДНК гликозилаза AP лиаза ДНК гликозилаза AP лиаза APE1 APE1 Pol δ/ε Polβ Polβ Fen-1/PCNA Polβ Lig1 Lig3 Фигура 3.11: схематично представяне на BER, съгласно [Scharer, 2003]; зелено: къс пластир - пътека, лилав дълъг път на кръпка; Съкращения в текста. AP ендонуклеаза-1 (APE1) хидролизира фосфатната връзка от 5-те страни на абазисните места. Полимеразата β (Polβ) вмъква нуклеотид последователно в абазисното място и след това отстранява абазисния сайт поради неговата активност на AP-лиаза. ДНК лигаза III (Lig3) затваря ника и по този начин възстановява първоначалната ДНК последователност. Ако BER се причинява от бифункционални ДНК гликозилази/APLyases 25
Теоретична позиция [Manach et al., 2004]. Освен това са възможни и клонове и връзки с не-флавоноиди. Проантоцианидините допринасят за горчивия и стягащ вкус в растителните храни [Jorgensen et al., 2004]. При ябълковите ябълки степента на полимеризация е главно между четири и единадесет единици флаванол [Manach et al., 2004]. 3.4.1.2 Флоретинови производни Флоретинът и неговите гликозиди (главно флоретин-2 -глюкозид = флоридзин и флоретин-2-оксилоглюкозид) принадлежат към дихидрохалконите, структурата им е показана на фигура 3.13. H H H R R = H: флоретин R = глюкоза: флоридзин Фигура 3.13: Структура на флоретин и флоридзин Те се срещат естествено почти изключително в ябълките, както и в листата и кората на ябълковото дърво. Друга точка на произход на флоретина е микробното разграждане на апигенин в дебелото черво (глава 3.4.4). 3.4.1.3 Производни на хидроксикинамиевата киселина Една от най-често срещаните хидроксикинамиеви киселини е кофеиновата киселина, която обикновено се среща в природата, естерифицирана с хининова киселина или с глюкоза. 5-кофеоилхиновата киселина е известна и под името хлорогенова киселина (Фигура 3.14). 30-ти
Теоретични основи HHRR = H: кофеинова киселина R = хинова киселина (C5): хлорогенова киселина HH 4 5 2 3 1 6 HH хинова киселина CH Фигура 3.14: Структури на кофеинова киселина и хлорогенова киселина съгласно [Belitz et al., 2001] Хлорогеновата киселина се намира главно в кафето и ябълките, но също така и в други плодове от семена и костилки [Belitz et al., 2001, Iwai et al., 2004]. В силно кафе могат да се постигнат нива до 500-800 mg/l [lthof et al., 2003]. Пиещите без кафе поглъщат до 100 mg хлорогенова киселина на ден, пиещите кафе, от друга страна, 500-1000 mg/дневно [lthof et al., 2001]. 3.4.2 Абсорбция Тъй като на фенолните съединения се приписват биоактивни ефекти in vivo, абсорбцията в тънките черва е задължително условие. Фигура 3.15 илюстрира възможните пътища на полифеноли от храната в стомашно-чревния тракт. Полифеноли Полфеноли Тъкан Чернодробно черво Дебелото черво Дебелото черво Жлъчка Бъбречни изпражнения Урина Фигура 3.15: Възможни пътища на полифеноли при хора, според [Scalbert and Williamson, 2000] Степента и механизмът на усвояване са противоречиви (Таблица 3.3). 31
Теоретична основа Таблица 3.3: Избор на in vivo и in vitro проучвания върху усвояването на производни на кверцетин Изследвано вещество Поглъщане Метаболити Литература пациенти илеостомия Кверцетин 1 гликозиди Лук рутин 24% 52% 17% [Hollman et al., 1995] Субекти (плазма в продължение на 24 часа) Гликозиди лук рутин гликозиди ябълка