Изследването на репликативното стареене на кучешки дермални фибробласти като принос към
От Ветеринарно-анатомичния институт на Ветеринарномедицинския факултет на Университета в Лайпциг Разследването на репликативното стареене на кучешки дермални фибробласти като принос към изследванията на стареенето Инаугурационна дисертация за придобиване на степен доктор медицина ветеринарни лекари (д-р med.vet.) От Ветеринарномедицинския факултет на Университета в Лайпциг подадено от Susanne Streit от Halle/Saale Leipzig, 2006
С одобрението на Ветеринарния факултет на Университета в Лайпциг Декан: проф. Д-р Карстен Фелхабер Ръководител: проф. Д-р мед. ветеринар. хабил. Франц-Виктор Саломон Рецензент: 1. Проф. Д-р мед. ветеринар. хабил. Институт по ветеринарна анатомия Франц-Виктор Саломон, Факултет по ветеринарна медицина, Университет в Лайпциг 2. Dr. обратно нат. хабил. Улф Андерег Катедра по експериментална дерматология Университетска клиника по кожа Лайпциг университет Лайпциг 3. Проф. Д-р. Д-р h.c. Вилфрид Крафт I. Медицинска ветеринарна клиника, Катедра по ветеринарна медицина, Университет „Лудвиг Максимилианс“, Ден на отбраната на Мюнхен: 19 декември 2005 г.
Съдържание 1 Въведение 1 2 Преглед на литературата 3 2.1 Стареене 3 2.1.1 Дефиниции на термина стареене 3 2.1.3 Средна и максимална продължителност на живота 4 2.1.4 Стареене на различни видове 4 2.1.5 Продължителност на живота на видовете кучета (Canis familias) 6 2.1.6 Ефекти на стареенето върху видовете кучета 9 2.2 Изследвания на стареенето 11 2.2.1 Теории за стареене 11 2.2.2 Нива на стареене според HAYFLICK (1985) 12 2.2.2.1 Теории за органи 12 2.2.2.2 Физиологични теории 12 2.2.2.3 Теории, основани на генома 13 2.2.3 Клетъчно стареене 14 2.2.4 Използване на фибробласти за експерименти in vitro 17 2.2.5 Поведението на фибробластите in vitro и връзката с максималната и средната продължителност на живота на даден вид, донорската възраст и здравословното състояние на донора 17 2.2.6 Определяне на параметрите на репликацията Стареене 20 2.2.7 Кучета при изследване на остаряването 21 2.2.8 Удължаване на живота 22 22 Животни, материал, методи 24 3.1 Тествани животни 24 3.2 Материя запор 25 3.2.1 Използвани химикали 25 3.2.2 Буфери и разтвори 26 3.3 Методи 27 3.3.1 Клетъчна култура 27 3.3.1.1 Материал на пробата 27 3.3.1.1.1 Вземане на проби 27 3.3.1.1.2 Приготвяне на проби 27
3.3.1.2 Култивиране на клетки 28 3.3.1.2.1 Условия на култивиране 28 3.3.1.2.2 Промяна на средата 28 3.3.1.2.3 Субкултивиране 28 3.3.1.2.4 Брой на клетки и оцветяване в трипан синьо 29 3.3.1.2.5 Замразяване на клетките 29 3.3.1.2. 6 Размразяване на клетките 29 3.3.1.2.7 Създаване на криви на растеж 30 3.3.2 Цитологични и имуноцитохимични изследвания 30 3.3.2.1 Оцветяване с Azan по Heidenhain 30 3.3.2.2 Оцветяване по Giemsa 31 3.3.2.3 Откриване на микоплазма чрез флуоресцентен анализ 31 3.3.2.4 Имунохистохимия 32 3.3. 3 Фотографска документация 33 3.3.3.1 Снимане на живите клетки 33 3.3.3.2 Снимане на направените клетъчни петна 34 3.3.3.3 Измерване на сниманите клетки 34 3.3.3.4 Статистически анализ и диаграми 34 3.4 Изчисляване на параметрите на клетъчната култура 34 4 Резултати 36 4.1 Предварителни тестове 36 4.2 Морфология на култивирани клетки 37 4.3 Флуоресцентен анализ 41 4.4 Имунохистохимия 42 4.5 Параметри на пролиферация на култивираните клетки 43 4.5.1 Общ брой клетки и жизненост d други клетъчни култури 43 4.5.2 Настройване на пролиферацията 46 4.5.3 Криви на растеж 48 5 Дискусия 55 5.1 Критика на методологията 55 5.1.1 Избор на опитни животни 55 5.1.2 Провеждане на експеримента 57 5.2 Значимост на културните системи като цяло и по-специално 60
6 Резюме 72 7 Резюме 74 8 Библиография 76
Списък на използваните съкращения ABC комплекс BSA CPDL DAB DAPI DMEM DMSO ДНК EDTA и сътр. FBS GSF HPDL IVL PBS PCR PDL PFA РНК TBS Трис Трис-HCl ЦНС Стрептавидин-Биотин Комплекс Стрептавидин-Биотин Комплекс Купулативно население Удвояване на ниво 3,3'-Диаминобензидин-Тетрахидрохлорид 4 ', 6-Диамидин-2'-Фениндохлол-дихидрохлор-дихенхидрол-дихидрохлорид Модифициран среден диметилсулфоксид Eagle дезоксирибонуклеинова киселина, дезоксирибонуклеинова киселина етилендиаминтетраоцетна киселина и други и други фетални говежди серуми Изследователски център за околна среда и здраве в Асоциацията Helmholtz Най-високо удвояване на населението In vitro продължителност на живота фосфатно буфериран физиологичен разтвор, фосфатна буферирана полимеразна полимеразна полимеза Верижна реакция Популация Удвояващо се ниво Параформалдехид рибонуклеинова киселина, Рибонуклеинова киселина Трис буфериран физиологичен разтвор, Трис буфериран физиологичен разтвор Трис (хидроксиметил) -аминометан Трис-хидрохлорид Козе нормален серум
Проблемното производство на фибробласти, ниските изисквания за култивиране и високият потенциал за делене на тези клетки представляват значително предимство пред други видове клетки (PEACOCKE et al. 1991, SMITH et al. 1984). Целта на настоящата работа е да изследва възможните връзки между възрастта на животното и пролиферативното поведение на неговите клетки (кожни фибробласти) (в рамките на кучешката порода Бигъл). За тази цел са установени първични и вторични клетъчни култури от кучешки дермални фибробласти от различни възрасти. Параметри като ниво на удвояване на популацията (PDL), кумулативно ниво на удвояване на популацията (CPDL), най-високо ниво на удвояване на популацията (HPDL), време на генериране и in vitro продължителност на живота (IVL) описват репликационния потенциал на култивираните клетки. Използвайки тези параметри, клетъчните култури на млади, възрастни и стари животни бяха сравнени помежду си. Резултатите от тази работа представляват възможна основа за по-нататъшни изследвания на клетъчното стареене на кучета с помощта на in vitro модели.