Изследване на краткосрочните ефекти на увеличената консумация на алкохол и цигари върху

субекти

абстрактно

Въведение

Безплодието засяга около 15% от двойките, които се опитват да забременеят, и в половината от тези случаи причината е свързана с репродуктивни проблеми при мъжете 1. Голям процент от случаите на безплодие при мъжете са идиопатични (

В Португалия консумацията на алкохол се е увеличила сред хората над 15-годишна възраст (средно 12,9 литра/човек/година) 14, докато около 32,4% от португалците над 15-годишна възраст пушат. Има силна традиция на остра злоупотреба с алкохол, цигари и наркотици по време на португалски академични тържества. Това осигурява изключителни условия за изследване на този проблем, тъй като голям брой млади мъже доброволно се излагат на високи нива на вредни фактори по време на точно определен и ограничен период от време, които са имали относително здравословен начин на живот преди и след излагане.

Целта на това проучване е да се изследват ранните и късните краткосрочни ефекти на острите промени в начина на живот, особено консумацията на алкохол и цигари, върху основните параметри на човешкия сперматозоид и оксидативен баланс. С оглед на значението на семенната плазма за узряването, храненето и защитата на спермата, беше оценена и функцията на епидидима и вторичните жлези.

Методи

Дизайн на проучването и участници

Ефектите на няколко фактора на начина на живот върху качеството на спермата бяха изследвани в проби от здрави млади доброволци от мъжки пол в репродуктивна възраст в три точно определени момента: преди (времева точка 1 - TP1), една седмица (времева точка 2 - TP2) и три месеца (времева точка 3 - TP3) след португалските академични тържества (7-дневно събитие), където злоупотребата с алкохол, цигари и наркотици е традиция (фиг. 1). Бяха взети предвид само онези доброволци, които предоставиха проба и в трите TP.

Неизмерените смути, срещани по време на академичните тържества, включват фактори като диета и промени в циркадния ритъм. TP, точки във времето.

Проучването беше рекламирано в университета в Авейро и като студенти от този университет бяха приети като доброволци. Рекламата ясно посочва хипотезата и основните цели на изследването и не се прилага финансова компенсация. Всички участници получиха ясни писмени инструкции за вземане на проби и отговориха на въпросник за подпомогнато изпълнение всеки път, когато беше взета проба. Въпросниците съдържаха въпроси за продължителността на въздържанието, предишни/скорошни заболявания, употребата на наркотици и алкохол, употребата на цигари и наркотици (като канабис и кокаин). Параметърът за консумация на алкохол се дефинира като приблизително общо количество алкохол (в грамове). В SP1 и SP3 този параметър отчита консумацията на алкохол на седмица през месеца преди академичните тържества. TP2 отразява консумацията на алкохол по време на академичната фестивална седмица. Параметърът на потреблението на цигари се определя като приблизителното общо количество никотин (в милиграми). В SP1 и SP3 този параметър отчита седмичната консумация на никотин през месеца преди академичните тържества. TP2 отразява консумацията на никотин през академичната седмица на фестивала. Всички данни са анонимизирани.

Етично признание

Това проучване беше одобрено от Комитета по етика и вътрешен преглед на болница Infante D. Pedro Hospital EPE, Авейру, Португалия (процес номер: 36/AO) и проведено в съответствие с етичните стандарти на Хелзинкската декларация. Всички участници получиха ясни писмени инструкции за дизайна на изследването и подписаха декларация за съгласие, позволяваща пробите да се използват за научни цели.

Вземане на проби от сперма, основен анализ на сперма и подготовка на сперматозоиди

Проби от сперма са получени чрез мастурбация в стерилен контейнер и са доставени в рамките на 30 минути за анализ на сперма. Всички проби са анализирани от опитни техници съгласно критериите на Световната здравна организация 15. Накратко, след като пробите от сперма бяха напълно втечнени при 37 ° С за около 30 минути, беше проведено макроскопско изследване. Микроскопското изследване включва анализ на подвижността, концентрацията и морфологията на спермата. Всички микроскопски анализи бяха извършени с помощта на микроскоп Zeiss Primo Star (Carl Zeiss AG, Германия). Пробите от сперма се промиват три пъти в PBS. Семенната плазма се събира от първото измиване и се използва за допълнителни тестове. Екстрактите от сперма се суспендират отново в 1% SDS. Концентрацията на протеин беше измерена с помощта на анализ на бицинхонова киселина (Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, САЩ) и крайната абсорбция беше измерена при 562 nm в четец за микроплаки (Infinite® 200 PRO серия, Tecan Trading AG, Швейцария).

Western blot анализ на експресията на антиоксидантните ензими супероксид дисмутаза 1 (SOD1) и глутатион пероксидаза 4 (GPx4)

Екстрактите от сперматозои се обработват с ултразвук, варят се и равни количества протеин (50 ug) се зареждат в 10% SDS-PAGE гел и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана. Имунодетекцията се извършва с помощта на миши анти-SOD1, 1: 1000 (MABC864, Merck Milipore, Дармщат, Германия) и заешки анти-GPx4 (ABC269, Merck Milipore, Дармщат, Германия), последвано от инкубация със съответния инфрачервен лъч -Вторични антитела (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd., Cambridge, UK). Бета-тубулин (Merck Milipore, Дармщат, Германия) беше използван като контрол на натоварването. Мембраната е сканирана с инфрачервена система за изображения на Odyssey (LI-COR Biosciences, Кеймбридж, Великобритания).

Определяне на карбонилната група (CG) чрез петно на прорези

Екстрактите от сперматозоиди, съдържащи 30 ug протеин, се дериватизират с 20 mM 2,4-динитрофенилхидразин, разтворен в 10% трифлуороцетна киселина и се неутрализират с 1,5 обемни части 2 M Tris с 18% меркаптоетанол. За да се извърши блотирането на прорезите, пробата се разрежда до 0,002 μg/μl и се въвежда в нитроцелулозна мембрана в устройството за блотиране на прорези (BioRad Portugal, Sintra, Portugal). Мембраната беше инкубирана с заешки анти-DNP, 1: 5000 (MAB2223, Merck KGaA, Дармщат, Германия), последвана от вторично анти-заешко инфрачервено антитяло (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd., Кеймбридж, Великобритания). Детекцията е извършена в системата за инфрачервени изображения Odyssey (LI-COR Biosciences, Кеймбридж, Великобритания).

Определяне на 3-нитротирозин (3-NT) в сперматозоидите чрез петно

Екстрактите от сперматозоиди бяха в 1xTBS до крайна концентрация 1? g/µ л разреден. Пробите се нанасят върху нитроцелулозна мембрана в петно (BioRad Portugal, Sintra, Portugal). След това мембраната беше покрита със заешки анти-нитротирозин, 1: 1000 (DAM1514077, Merck KGaA, Дармщат, Германия), последвана от вторично анти-заешко инфрачервено антитяло (1: 5000, LI-COR Biosciences UK Ltd, Кеймбридж, Великобритания) инкубира. Детекцията е извършена в системата за инфрачервени изображения Odyssey (LI-COR Biosciences UK Ltd., Cambridge, UK).

Общо антиоксидантно състояние (TAS)

Концентрацията на антиоксиданти в сперматозоидите се измерва с помощта на анализа на общия антиоксидантен статус (TAS) (NX2332, Randox Laboratories, Crumlin, Северна Ирландия). Протоколът, предоставен от производителя, е модифициран, за да може да се използва микроплаки (реагентите и количествата на пробите са намалени).

Биохимичен анализ на маркери на епидидима и спомагателни полови жлези

Биохимичните маркери на функцията на епидидима (неутрална α-глюкозидаза, NAG), функцията на простатата (лимонена киселина) и функцията на семенните везикули (фруктоза) бяха оценени в семенната плазма. Общата активност на NAG беше измерена, като се използва наличен в търговската мрежа комплект EpiScreen Plus α-глюкозидазен анализ (FertiPro, Beernem, Белгия), съгласно инструкциите на производителя. За количествено определяне на количеството фруктоза в семенната плазма се използва тестът за фруктоза (FertiPro, Beernem, Белгия) в съответствие с инструкциите на производителя. Съдържанието на лимонена киселина в семенната плазма се измерва с помощта на теста за лимонена киселина (FertiPro, Beernem, Белгия) съгласно инструкциите на производителя.

Статистически анализ

Резултати

В това проучване са включени общо 36 здрави кавказки ученици от мъжки пол на средна възраст 22 ± 3 години. Не са докладвани предишни бременности, съпътстващи медицински заболявания, употреба на лекарства или наркотици сред участниците в набора от данни. Описателен анализ на резултатите е представен в таблица 1. По-долу са описани само статистически значимите резултати (фиг. 2, таблица 2). Всички двойни разлики между времената на изследване (TP) са описани в допълнителна таблица S1.

Кутия Парцел алкохол ( А. ) и консумация на никотин ( Б. ), основният параметър на спермата ( ° С. - К ), маркерът за оксидативен стрес ( L. ) и функцията на епидидима ( М. ) и допълнителните полови жлези ( н и О ) в различни точки на времето (TP). Стойностите на Р от тестове със сдвоени проби са обобщени в таблица 2.

Влияние на академичните тържества върху основните параметри на спермата и маркерите за оксидативен стрес на спермата

Консумацията на алкохол на ден се е увеличила повече от осем пъти между TP1 и TP2. В TP3 стойностите на консумацията на алкохол спаднаха до основните стойности (TP1) (Фиг. 2А; Таблица 2). При TP2 консумацията на никотин се е увеличила значително в сравнение с TP1 (2 пъти) (2B; Таблица 2).

Наблюдавани са разлики в основните параметри на семената (Фиг. 2C-K; Таблица 2). Обемът на спермата показва значително намаление в сравнение с TP (18% от TP1 до TP2; 19% от TP2 до TP3; 33% от TP1 до TP3) (ФИГ. 2С, Таблица 2). Концентрацията на сперматозоидите и общият брой на сперматозоидите в еякулата намаляват значително от TP1 до TP3 (съответно 20% и 52%) (2D и E; Таблица 2). Процентът на прогресивна подвижност намалява от TP1 на TP2 (15%) (Фиг. 2F; Таблица 2). Процентът на непрогресиращи подвижни сперматозоиди се е увеличил спрямо TP (40% от TP1 до TP2; 50% от TP1 до TP3) (ФИГ. 2G; Таблица 2). Процентът на неподвижни сперматозоиди намалява значително от TP1 до TP2 (14%) (ФИГ. 2Н; Таблица 2). По отношение на морфологията на сперматозоидите, процентът на нормалните сперматозоиди е значително по-висок в TP1 в сравнение с TP2 и TP3 (2I; Таблица 2). По-специално, грешките на главата и централната част бяха по-високи в TP2, отколкото в TP1 и TP3 (Фиг. 2J и K; Таблица 2).

Съдържанието на 3-нитротирозин (3NT) в сперматозоидите е единственият маркер за оксидативен стрес, който показва значителна промяна (Фиг. 2L; Таблица 2). В TP2 нивата на остатъци от тирозин, които страдат от нитриране, са 1,4 пъти по-високи от тези в TP3.

Влияние на академичните тържества върху функцията на епидидима и спомагателните полови жлези

Налице е значително намаляване на активността на неутралната а-глюкозидаза (NAG) в еякулата от TP1 до TP3 (46%) и от TP2 до TP3 (35%) (ФИГ. 2М; Таблица 2). По отношение на общото количество фруктоза в еякулата също се наблюдава значително намаление от TP1 до TP3 (28%) и от TP2 до TP3 (23%) (2N; Таблица 2). Общото количество лимонена киселина в еякулата е значително по-ниско в TP3 в сравнение с TP1 (36%) (2O; Таблица 2).

дискусия

Различни фактори за начина на живот са свързани с репродуктивните проблеми на мъжете 5, 6, 16, 17. Въпреки това, проучванията, разглеждащи ефектите на токсичните вещества върху сперматозоидите, са противоречиви и често са предубедени 5, 18, 19. За да се преодолеят тези проблеми, академичните тържества бяха използвани като учебен модел, тъй като многобройни промени в начина на живот настъпиха едновременно в рамките на 7 дни (фиг. 1). Този модел осигурява изключителни условия за изучаване на ефектите от острите промени в начина на живот върху младото и здравословно население.

Нашето проучване показва, че острата консумация на алкохол и цигари, заедно с други злоупотреби, на които доброволците са били изложени през учебната седмица, са имали значителни ранни (SP2) и късни (SP3) краткосрочни ефекти върху качеството на спермата (Фигури 2 и 3). . Както се очакваше, консумацията на алкохол и цигари се увеличи по време на академичните тържества в сравнение с нивата, наблюдавани една седмица преди и три месеца след академичните тържества (фиг. 2). Тази внезапна промяна в начина на живот е свързана с вредни ефекти върху качеството на спермата, както рано, така и късно. Обемът на спермата, концентрацията на сперматозоидите, общият брой на сперматозоидите, прогресивната подвижност и нормалната морфология са намалени заедно с активността на NAG и количеството на фруктоза и лимонена киселина в еякулата. В допълнение, процентът на непрогресиращи и неподвижни сперматозоиди се увеличава заедно със стойностите на нитрация на протеин (Фиг. 2 и 3).

Съобщава се, че хроничната консумация на алкохол и цигари може да доведе до неправилно функциониране на допълнителните жлези 20, 21. Нашите резултати показват, че острите промени в начина на живот имат краткосрочен негативен ефект върху функцията на епидидима и спомагателните полови жлези, което също се отразява в намаляване на обема на спермата в TP.

Настоящото проучване също така показва, че острите промени в начина на живот, главно поради повишената консумация на алкохол и цигари, оказват значително влияние върху морфологията на сперматозоидите. Една седмица (TP2) и 3 месеца (TP3) след острите промени в начина на живот са наблюдавани увеличен брой дефекти на главата и средната секция и намален дял на морфологично нормални сперматозоиди, което показва ефект върху морфологично зрелите сперматозоиди в епидидима и върху образуването на сперматозоиди в тестисите може да се затвори (фиг. 2). Едно проучване показа, че много малко алкохолни мъже са нормозооспермични, което усилва вредното въздействие на алкохола върху морфологията на сперматозоидите 5. Както концентрацията на сперматозоидите, така и процентът на морфологично нормални сперматозоиди са намалели 3 месеца след академичните тържества, което предполага, че процесът на сперматогенеза е бил нарушен.

Информативната стойност на изследването е ограничена от относително малкия общ обем на извадката и риска от погрешна класификация поради използването на ретроспективна информация за излагането на алкохол, цигари и наркотици. Трябва да се вземе предвид и пристрастието при подбора, тъй като всички доброволци са били от бялата раса. Освен това не можем да изключим, че резултатите ни се дължат на неизмерени объркващи фактори, включително диета, промени в циркадния ритъм, упражнения и стрес.

Поради обичайното поведение на населението по време на академичните тържества беше много трудно да се наемат субекти, които не променят начина си на живот в TP2. Всъщност само 2 души от нашата извадка отговарят на този критерий. Въпреки това може да се забележи, че общата тенденция в резултатите предполага, че промените в начина на живот имат неблагоприятен ефект върху качеството на спермата. Ако резултатите се дължат на естествените разлики в анализа на спермата, ще се очаква случаен модел на промяна.

Минималният размер на извадката не е изчислен поради липса на информация за популацията. Размерът на набора от данни обаче се счита за разумен, тъй като теоремата за централната граница позволява разпределението на променливите да се доближи до нормално разпределение.

Това проучване допринесе за по-доброто разбиране на патофизиологията, в основата на влошаването на качеството на спермата, причинено от остри промени в начина на живот. Това предполага, че особено високата консумация на алкохол и цигари е свързана с намалено качество на спермата при здрави млади мъже и че има отрицателен ефект върху всички параметри на спермата. Повишаване на оксидативния стрес върху сперматозоидите и нарушена функция на епидидима и допълнителните полови жлези. Следователно здравите мъже могат да бъдат посъветвани, че случайните остри промени в начина на живот в краткосрочен план влошават тяхната плодовитост. Необходими са повече изследвания, за да се разбере дали качеството на спермата се възстановява или острите промени в начина на живот имат дългосрочни ефекти.

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Vieira Silva, J. et al. Изследване на краткосрочните ефекти на увеличената консумация на алкохол и цигари върху качеството на спермата на здрави млади мъже. Sci. Представител. 7-ми, 45457; doi: 10, 1038/srep45457 (2017).

Бележка на редактора: Springer Nature остава неутрален по отношение на исканията за юрисдикция в публикувани карти и институционални връзки.

Още информация

PDF файлове

Допълнителна таблица S1

Забележки

Изпращайки коментар, вие се съгласявате с нашите условия за използване и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, маркирайте го като неподходящо.