Използването на орофарингеална интратрахеална PAMP администрация и бронхоалвеоларен лаваж за

Обобщение

Имунният отговор на гостоприемника към патогенна инфекция е строго регулиран процес. С помощта на модел на експозиция на липополизахарид в белите дробове при мишки е възможно да се направят оценки с висока резолюция на сложните механизми, свързани с развитието на заболяването.

Резюме

Въведение

Описаните протоколи са много гъвкави и могат лесно да бъдат модифицирани, за да се оцени широк спектър от PAMP и свързаните с тях увреждания на молекулярните модели (отслабени). Освен това, с няколко допълнителни модификации, тези протоколи могат да се прилагат и за проучвания, които показват прогресия на алергични респираторни заболявания или взаимодействия между гостоприемник и патоген с живи бактерии, вируси или гъби 5-10.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички изследвания са проведени с одобрението на Комитета за институционални грижи и употреба (IACUC) за Вирджиния Тех и в съответствие с Националното ръководство за грижа и използване на лабораторни животни.

1. Интратрахеално (и) инокулиране на LPS с орофарингеално приложение

2. Събиране на серум и бронхоалвеоларен лаваж (BAL)

900 μl в трахеята, надувайки белите дробове и незабавно изтегляйки HBSS. Поставете задния BALF в конична тръба от 15 ml.

  • Повторете тази промивка още 2 пъти, за да съберете приблизително 3 ml BALF за бъдещ анализ. Съхранявайте BALF върху лед или при 4 ° C до употреба.

    • 3. Хистопатологичен препарат

    1. Центрифугирайте цялата кръв, събрана в стъпка 2.5 при 12 000 xg за 5 минути, за да изолирате серума. Серумът в предварително маркирана епруветка за микроцентрифугиране от 1,5 ml и се съхранява при -80 ° C
    2. Оценете серумните нива на цитокини чрез ELISA или подобен тест. Разредете серума от 1,05 до 1,20 в подходящ буфер за разреждане в зависимост от анализа в съответствие с инструкциите на производителя. Тези разреждания трябва да се определят емпирично, преди да бъдат проведени по-голямата част от пробите.
    3. Поради малкия обем получен серум, намалете обема на пробата върху плаката ELISA с половин зареждане. Например, повечето търговски ELISA използват 100 µl обеми стандарти и проби. За да спестите проби, заредете 50 μl стандарти и разреден серум на гнездо.
    4. Центрофугирайте BALF в хладилна настолна центрофуга при 200 g за 5 минути. Прехвърлете безклетъчната супернатанта в две предварително маркирани епруветки за микроцентрифугиране от 1,5 ml и съхранявайте при -80 ° C
    5. Оценете BALF цитокините чрез ELISA или подобен тест без разреждане.
    6. Неизползван серум и BALF при -80 ° C

    5. Диференциално оцветяване и оценка на BAL клетъчност

    6. Оценка на хистопатологията

    1. Подгответе белите дробове за хистопатологична оценка. След 24-48 часа фиксиране на формалин, целият надут бял дроб се ориентира вентрално и е вграден в парафин. Изрежете блоковете, за да разкриете резултатите от главния поток.
    2. За да се подобри точността на оценяване, разположете белите дробове в същото положение и подрежете всеки блок, което води до максимална надлъжна визуализация на основните интрапулмонални аксиални дихателни пътища. От този момент изрежете серийни секции от 5 микрона и оцветете с хематоксилин и еозин (H&E). Допълнителни секции могат да бъдат изрязани и подготвени за in situ хибридизация, като се използват стандартни протоколи.
    3. Оценете хистопатологията, използвайки полуколичествена система за оценка въз основа на следните възпалителни параметри, които се оценяват между 0 (отсъства) и 3 (тежки): мононуклеарна и полиморфно-ядрена клетъчна инфилтрация; Хиперплазия и нараняване на епителните клетки на дихателните пътища; Екстравазация; периваскуларни и перибронхооларни мушкания; и процента на белите дробове, свързани с възпаление. Хистопатологията на белите дробове трябва да бъде оценена от опитен патолог.
    4. Усреднете всички стойности на параметрите, за да генерирате общ хистопатологичен резултат или използвайте индивидуални резултати за количествено определяне на специфични аспекти на прогресията на заболяването. Правете всички точки по двойно сляп начин, като рецензенти са заслепени както за генотипа, така и за лечението. Системата за точкуване е описана по-рано 6,7,10.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    Прилагането на LPS индуцира високи нива на локални и системни провъзпалителни медиатори, включително няколко цитокини, свързани с вродения имунен отговор. Местните нива на цитокини в BALF се оценяват с помощта на конвенционални техники като ELISA. Честите цитокини, които се регулират в белите дробове след приложение на LPS, включват TNF-α, IL-1β и IL-6 (Фиг. 2А). Системни нива на цитокини в серума, като се използва същата техника като оценката на BALF (2 Б) описани, оценени. Не е необичайно някои медиатори да присъстват в местната микросреда, но да присъстват в серума. Например TNF-α рутинно се открива при високи нива в белите дробове след LPS, но обикновено не се открива системно при условията, описани в този протокол (Фиг. 2А и 2 В; под границата на откриване).

    орофарингеална
    2. Дихателната експозиция на LPS води до повишени нива на локални и системни цитокини. А) След излагане на LPS, местните нива на широк спектър от възпалителни цитокини могат да се наблюдават в BALF през първите 24 часа, включително TNF-α, IL-1β и IL-6. Тези цитокини могат да бъдат оценени с ELISA, както е показано тук, 24 часа след излагане на LPS. Б) Няколко цитокини също могат да бъдат открити системно в серума. Има обаче няколко изключения, включително TNF-α, които се намират във високи концентрации в BALF в серума, но не. Цитокините, които представляват интерес за серума, трябва да бъдат оценени емпирично преди широкомащабна оценка. Щракнете тук за по-голям изглед .

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Основните стъпки за успешна оценка на имунния отговор в белия дроб на мишката са както следва: 1) изберете подходящия щам на мишката и пол за модела, който се оценява; 2) оптимизиране на доставката на PAMP до белите дробове; 3) правилно да събира и обработва BALF; и 4) правилно фиксиране и подготовка на белите дробове за хистопатологични оценки.

    Установено е, че орофарингеалното приложение е по-точно от другите форми на доставяне на лекарството в белите дробове 2. Това до голяма степен се дължи на директен достъп до дихателните пътища и заобикаляне на проблеми, свързани с отлагането в носа и максиларите. Въпреки това, както при всички тестове върху животни, това изисква обширни ръчни умения и практика за постигане на управление на знанията. Неправилната техника може да доведе до неефективни бели дробове и в някои случаи до нараняване на животните. Обикновено Evans Blue Dye (EBD) може ефективно да се използва или като инструмент за обучение за тази процедура, или за отстраняване на възможни проблеми, свързани с депозита 4. EBV може да се прилага и след това да се екстрахира от тъканта с помощта на формамид. Количеството EBD може да се изчисли, като се използват нива на абсорбция в сравнение със стандартна крива. В нашите ръце типичното възстановяване на EBD варира между 90-98%. Твърди се, че по-голямата част от неусвоеното багрило е свързано с изтичане в хранопровода. Поради своята точност, технологията за ИТ администриране е идеална за доставяне на различни чувствителни на дозата вещества в белите дробове, като активни фармацевтични съставки или инфекциозни организми.

    t "> Тази процедура е оптимизирана за доставяне на LPS и други PAMP до белите дробове на мишки. След като тези техники бъдат усвоени, могат да се задействат и допълнителни изследвания, като се използват модифицирани протоколи за ефективна оценка на взаимодействията между гостоприемниците и патогените с живите патогени. По същия начин и тези тук Описаните техники са много гъвкави и могат да се използват за всеки интерес, който се интересува от оценката на клиничната и физиологичната значимост на експериментален или фармацевтичен агент. Поради точността на дозировката, тази техника е идеална и за in vivo изследвания, които изискват високи нива Прецизност при доставка на средства.

    Тази процедура е оптимизирана за доставяне на LPS и други PAMP в белите дробове на мишки. След като тези техники бъдат усвоени, могат да се задействат и допълнителни проучвания, използващи модифицирани протоколи за ефективна оценка на взаимодействията между гостоприемника и патогена с живи патогени. По същия начин, описаните тук техники са много гъвкави и могат да бъдат приложени към всяко проучване, интересуващо се от оценка на клиничната и физиологичната значимост на експериментален или фармацевтичен агент. Поради точността на дозировката, тази техника е необходима и за in vivo проучвания, които изискват висока степен на точност при доставянето на активните съставки.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Разкриване

    Авторите заявяват, че няма конкуриращи се финансови интереси.