Използване на In vitro флуоресцентен резонансен трансфер на енергия за изследване на динамиката на протеиновите комплекси при

Обобщение

Взаимодействията между протеин и протеин са от решаващо значение за биологичните системи, а изследванията на кинетиката на свързване дават представа за динамиката и функцията на протеиновите комплекси. Описваме метод, който количествено определя кинетичните параметри на протеинов комплекс, използвайки флуоресцентен резонансен трансфер на енергия и техника на спрян поток.

Резюме

Въведение

Биологичната активност в крайна сметка се извършва от протеини, повечето от които взаимодействат с другите за правилни биологични функции. Използвайки изчислителен подход, общото количество протеин-протеинови взаимодействия при хора се очаква да бъде 650 000

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Изтеглете структурния файл на комплекса Cul1 • Cand1 от банката с протеинови данни (файл 1U6G).
Покажете структурата на комплекса в PyMOL Cul1 • Cand1.
Функцията за измерване в меню " Асистенти "от PyMOL за да се изчисли разстоянието между първата аминокиселина на Cand1 и последната аминокиселина на Cul1 (Фигура 1).
Изтеглете онлайн инструмента за преглед на спектри (вж Таблица на материалите) и показват спектри на възбуждане и излъчване на 7-амино-4-метилкумарин (AMC) и мигат едновременно (Фигура 2). Имайте предвид, че AMC е донорът на ладове, а Blitz е акцепторът на ладовете.

Фигура 1: Кристалната структура на Cul1 • Cand1 и измерване на разстоянието между потенциалните места за етикетиране. Файлът с кристалната структура е изтеглен от Протеинова банка данни (файл 1U6G) и е разгледан в PyMOL. Измерванията между избрани атоми се извършват от PyMOL. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

Фигура 2: спектрите на възбуждане и излъчване на флуоресцентни багрила за Bund. Показват се спектрите на AMC (7-амино-4-метилкумарин) и FlAsH. Прекъснатите линии показват спектри на възбуждане, а плътните линии показват спектри на излъчване. Първоначално изображението е генерирано от флуоресцентния SpectraViewer и е модифицирано за по-голяма яснота. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

2. Приготвяне на Cul1 AMC • Rbx1, FRET донорен протеин

Конструирайте плазмиди за експресия на човешка Cul1 сортаза • Rbx1 в клетки на E. Coli. Имайте предвид, че двата плазмида Co, експресиращи човешки Cul1 • Rbx1 в клетките на E. Coli, са описани подробно в по-ранен доклад 20.
1. Добавете ДНК последователност, кодираща "LPETGGHHHHHH" (сортаза, seine6 ден) към 3 'края на кодиращата последователност Cul1 чрез стандартни PCR и методи за клониране 21, 22 .
2. Последователност на новия плазмид, за да се потвърди, че генната вложка е точна.
Co Express Cul1 сортаза • Rbx1 в клетките на E. Coli. Методът е извлечен от предишен доклад 20.
1. Смесете 100 ng от два плазмида с BL21 (DE3) химически компетентни клетки за съвместна трансформация, като използвате Heat Shock Method 23. Растете клетки върху LB агарна плака със 100 µg/mL ампицилин и 34 µg/mL хлорамфеникол при 37 ° C през нощта.
2. Инокулирайте 50 ml LB култура с прясно трансформирани колонии и растейте една нощ при 37 ° C, разклащайки с 250 rpm. Това дава начална култура.
3. Инокулирайте 6 бутилки, всяка с 1 L LB среда с 5 mL стартова култура, всяка и отглеждайте при 37 ° C с 250 rpm разклащане до OD600
  
  3. Подгответе Flash-Cand1, протеина на акцептора Bund
  
  Забележка: Повечето стъпки в тази част са същите като стъпка 2. Условията, които се различават, са описани подробно по-долу.
  
  40 µM чрез прехвърляне на буфера чрез мембранна ултрафилтрация (30 kDa прекъсване). Изчислете концентрацията на протеина, като използвате абсорбцията при 280 nm. Запазете протеина като 50 µL аликвотни части при -80 ° C.
  Забележка: Протоколът може да бъде поставен на пауза тук.
Създаване на Flash Cand1.
1. Добавете разтвор за флаш 1 µL (вж Таблица на материалите) до 50 µL разтвор TetraCys Cand1.
2. Разбъркайте добре и инкубирайте сместа на стайна температура на тъмно в продължение на 1-2 часа до FlAsH Cand1.
  Забележка: Протоколът може да бъде поставен на пауза тук.

4. Пригответе Cand1, протеина Bund chase

ЗАБЕЛЕЖКА: Протоколът за приготвяне на протеини е подобен на стъпка 3 със следните промени.

Вмъкнете кодиращата последователност на вечерната Cand1 в pGEX-4 t-2 вектор.
Сменете буфера, използван в стъпка 3.3.5, на буфер, съдържащ 30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DVB-t, 10% глицерол.
Премахнете стъпки 3.3.7 и 3.3.8.

5. Тествайте и потвърдете анализа на Bund

6. Измерете обединението на константата на скоростта (купете) на Cul1 • Cand1

ЗАБЕЛЕЖКА: Подробности за работата на флуориметър със спрян поток са описани в по-ранен доклад 26.

7. Измерете константата на скоростта на дисоциация (koff) на Cul1 • Cand1 в присъствието на Skp1 • F-box протеин.

Забележка: Тази стъпка е подобна на стъпка 6 със следните промени.

В спринцовка А, под позицията да попълня, Заредете разтвор от 100 nM Cul1 AMC • Rbx1 и 100 nM FlAsH Cand1 в снопа от буфер. Завъртете примера за позицията "Драйв".
Заредете в спринцовка В под позицията да попълня, решение на Skp1 • Skp2 (изготвено съгласно предходен доклад 20). Завъртете примера за позицията "Драйв".
Отвори това Контролен панел под придобивам в софтуера и запишете емисията на програма Cul1 AMC за 30 s. След това направете един изстрел. Флуоресцентните сигнали се увеличават с течение на времето след смесване на разтвор A спринцовка и спринцовка B (Фигура 5).

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Фигура 3: Представителен анализ на Bund за образуване на комплекс Cul1 • Cand1. Пробите в куп буфер (30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,5 mM DVB-t, 1 mg/ml овалбумин, pH 7,6) бяха ентусиазирани при 350 nm и емисиите бяха сканирани от 400 nm до 650 nm. (А) Емисионни спектри на 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 (пълен) и смес от двете (FRET). Cand1 (пълен) означава пълна дължина Cand1. (Б) Емисионни спектри на 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 и смес от двете (FRET). При този експеримент и след това беше използван Cand1 с изтритата му първа спирала. (° С) Chase емисионни спектри от 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1, смес от двете (FRET) и контрол за Bund (Chase). Пробата Chase съдържа 70 nM Cul1 AMC, 700 nM Cand1 и 70 nM FlAsH Cand1. (Д) Емисионни спектри на 70 nM Cul1 AMC, смес от 70 nM Cul1 AMC и 70 nM FlAsH Cand1 (Bund) и 700 nM Skp1 • Skp2, добавен към 70 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1 комплекс. Във всеки график емисионните сигнали бяха нормализирани до емисията от 70 nM Cul1 AMC при 450 nm. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

За да измерим закупуването на Cul1 • Cand1, използвайки установения тест FRET чрез намаляване на сигнала на кодера с течение на времето на флуориметъра със спрян поток, първо тествахме и определихме концентрацията на протеина, който ще се използва. Когато се използват 5 nM Cul1 AMC и FlAsH Cand1, се наблюдава много малка промяна на сигнала (Фиг. 4А) като има предвид, че когато концентрацията на всеки протеин се повиши до 50 nM, се наблюдава намаляване на сигнала във времето (Фигура 4b) и тази промяна беше отменена, когато буфери без FlAsH Cand1 (Фигура 4) беше добавено. Следователно 50 nM Cul1 AMC се използва за по-нататъшен анализ и редица наблюдавани константи на скоростта на асоцииране (kObs) се измерват чрез смесване на 50 nM Cul1 AMC с нарастващи концентрации на FlAsH Cand1. KObs за всеки експеримент се изчислява чрез включване на препратките към експоненциална крива и kObs, получени от същата концентрация на FlAsH Cand1, са осреднени. Нанесете средните kObs с концентрацията на Cand1 и линейна регресия (Фигура 4) изпълнява, покупката е определена 7.27 .

Фигура 4: Представително измерване на константата на скоростта на клуба. (А) флуоресценцията на 5 nM Cul1 AMC се наблюдава с флуориметър със спрян поток с течение на времето след добавяне на 5 nM FlAsH Cand1. (Б) флуоресценцията на 50 nM Cul1 AMC се наблюдава с флуориметър със спрян поток с течение на времето след добавяне на 50 nM FlAsH Cand1. (° С) флуоресценцията на 50 nM Cul1 AMC се наблюдава с флуориметър със спрян поток с течение на времето след добавянето на бунд Bund. (Д) купи за облигацията Cand1 към Cul1. k-Obs на Cul1 • Показани са Cand1 при различни концентрации на Cand1. Линейният наклон дава покупка 1,8 x 10 7 M -1 s -1. За показване на ленти за грешки ± SEM; n = 4. Всички проби бяха приготвени в буфер и се възбудиха при 350 nm. Използва се лентов филтър за събиране на сигнали от AMC и за изключване на светкавични сигнали. Няма данни, които са нормализирани. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

Подобно на измерването на покупката, ние измерихме наблюдаваната постоянна дисоциация на Cul1 • Cand1 чрез проследяване на нарастването (възстановяването) на донорния сигнал във времето на флуориметъра със спрян поток. Cul1 AMC и FlAsH Cand1 се смесват първо и след това Skp1 • Skp2 се добавя към предварително сглобения Cul1 AMC • FlAsH Cand1 на флуориметъра със спрян поток. Сигналът на кодера се увеличава бързо и той разкрива kObs от 0,4 s -1 (Фигура 5). За разлика от това, когато буферът е добавен към предварително сглобения Cul1 AMC • FlAsH Cand1, не се наблюдава увеличаване на сигнала, което предполага, че бързата дисоциация на Cul1 • Cand1 е предизвикана от Skp1 • Skp2.

Фигура 5: Представително измерване на константата на скоростта на дисоциация. Промяната в донорната флуоресценция в сравнение с времето се измерва след добавяне на 150 nM Skp1 • Skp2 или Bund буфер към 50 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1 комплекс. Промените в сигнала бяха приспособени към експоненциална крива и се наблюдава константа на скоростта на дисоциация 0,4 s -1. Експерименталните условия са подобни на тези на Фигура 4описано. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Тъй като фретът е чувствителен и количествен, той се превърна във важен инструмент за изучаване на взаимодействието между макромолекулите. Този протокол дава пример за използването на фрета за изследване на динамиката на протеиновия комплекс в разтвор. Bund също е използван заедно с изображенията на живи клетки за изследване на молекулярни взаимодействия в живи клетки 36, което е мощно за разкриване на динамиката на протеиновите комплекси при физиологични условия. В допълнение, fret може да се използва и на ниво единична молекула, изучавайки динамиката в реално време на макромолекулните комплекси 37, 38, изучавайки прозрения за конформационната промяна на комплекса. За подобряване на ефективността и откриването на праг, голям интерес представляват флуорофорите и биосензорите с яркост и фотостабилност, които активно се разработват и изучават 28, 39 .

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.