Ин-витро анализ

За много изследвания, които не са възможни върху тестови субекти, ин витро процедурите за тестване стават все по-важни.

За козметични продукти, които често се използват в продължение на дълъг период от време, дерматологичните тестове за безопасност са съществена предпоставка за високо ниво на безопасност на приложението и удовлетвореност на клиентите. Чрез определяне и оценка на надеждни и възпроизводими биологични крайни точки въз основа на хистологични и биохимични анализи може да се направи изявление за ефектите на продукта върху регенеративните биологични процеси на кожата.

3D моделът на кожата е особено подходящ за такова изследване, тъй като формира естествената хистологична последователност от епидермални клетъчни слоеве и кожни структури, както е известно от човешкия епидермис. Базалният слой, базалният кератиноцитен слой, лежи директно върху еквивалент на жива дерма (фибробласти) и хистологично е последван от слоя spinosum и слоя гранулозум, които накрая са покрити от роговите клетъчни слоеве на роговия слой.
Нарушенията на редовната епидермална корнификация (ортокератоза), причинени от различни дразнители от физическо (механично, UV-A/B) или химическо (SLS) естество, могат да бъдат анализирани и оценени количествено и качествено.

В проучванията in vitro изследваме:

Целостта на кожната бариера/регенерация след увреждане,
UVA/B щети,
Съвместимост на продукта.

епидермална диференциация,
Кожна бариера на съответните структури,
жизненост,
Целостта на дермо-епидермалната зона (DEJ),

Морфологично-хистологични структури след специално оцветяване,
Имунофлуоресцентно оцветяване на протеини, участващи в диференциацията на корнеоцитите,
Количествено определяне на интерлевкини (напр. IL-1α, Il-6) с помощта на ензимно свързан имуноабсорбиращ анализ (ELISA),
други методи в разработка.

Хистологичен анализ

Хистологията е наука за биологичните тъкани (histos = тъкан и logos = обучение). С помощта на хистологията, тъканно-морфологичните промени на клетъчно ниво могат да бъдат направени видими чрез специфично оцветяване и съответно оценени. Най-често срещаното оцветяване, използвано в хистологията и хистопатологията, е H&E оцветяването. Тук нуклеиновите киселини са интензивно оцветени в тъмно синьо, цитоплазмата и съединителната тъкан в розово-червено. Фигурата по-долу показва H&E оцветяване на здрав модел (A) и UVB-изложен, повреден модел (B).

Оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) на ултратънък участък А) необработен модел Б) Модел, облъчен с UVB (250 mJ/cm2) след 48 часа. затворени стрелки: изгорени от слънцето клетки; отворени стрелки хидропични клетки (масивно натрупване на течност). *: типична дискератоза (разстройство на роговицата) след излагане на ултравиолетови лъчи.

Моделът показва всички физиологични слоеве (stratum basale, spinosum, granulosum и corneum) на местната човешка кожа, както и истинска роговица (A). Фигура Б показва модел 48 часа след излагане на UVB (250 mJ/cm2).
Типичните черти на слънчевите изгаряния са ясно разпознаваеми. Многобройни така наречени „изгорени от слънцето клетки“ (затворена стрелка), хидропични клетки, които съдържат повече течност и по-слабо оцветено ядро (отворени стрелки), както и типичното разстройство на роговицата (дискератоза).
Освен това могат да се видят изолирани вакуолизирани кератиноцити. Използвайки този модел, защитната функция (защита от слънцето) и/или регенеративният потенциал на формулировка или отделни вещества могат да бъдат изследвани и оценени на клетъчно ниво.

Анализ на скоростта на клетъчното делене

Скоростта на клетъчно делене (пролиферация) е важен показател за жизнеността или „годността“ на дадена тъкан. В човешкия епидермис само кератиноцитите на базалния слой (базални кератиноцити) са способни на клетъчно делене. Те компенсират загубените корнеоцити чрез постоянния процес на ексфолиране, като по този начин осигуряват хомеостазата на тъканта и предотвратяват клетъчното изтъняване на епидермиса.

Ултра тънък участък на пълен модел кожа. A) изображение с ярко поле Б) изображение с флуоресценция. Синьо = клетъчни ядра, червено: делящи се клетки.

Използвайки технологията Click-It EdU®, базалните кератиноцити на епидермиса и фибробластите на дермата могат да бъдат специално маркирани (A + B) в модела на кожата по време на клетъчното делене (митоза). Това може да се използва, за да се определи дали дадено вещество или формулировка влияе върху поведението на клетъчното делене след определено локално или системно приложение и време за лечение.
Извършването на нелекуван контрол позволява да се определи количествено процентът на скоростта на клетъчно делене. Примери за повишена активност на клетъчното делене: зарастване на рани, възпалителни процеси.

Целостта на кожната бариера

Друг важен параметър за здрава кожа е непокътнатата бариера на кожата, която от една страна предотвратява прекомерната загуба на вода, а от друга страна представлява ефективен защитен щит срещу патогени, влияния на околната среда и (химични) вредни вещества.

Ултра тънък участък на пълен модел кожа. А) Лечение със стерилен PBS B) 45-минутно лечение с 1% SDS.
Синьо = клетъчни ядра, зелено: Луцифер Жълто оцветяване.

Отделни вещества, пълни формулировки или химически нокса могат да повлияят на целостта на кожната бариера. Това може да доведе до повишена загуба на вода (повишено изпаряване) и абсорбиране на вредни агенти от околната среда, които (пасивно) попадат в кожата. В модела с пълна кожа показаният цвят Lucifer Yellow може да се използва за изследване дали даден продукт влияе върху кожната бариера. Стерилната вода или PBS (буфериран с фосфат физиологичен разтвор) не оказват влияние върху целостта на бариерата (A). Локално нанесеното багрило остава изцяло в горните слоеве на кожата (рогов слой).
45-минутно лечение с повърхностноактивно вещество SDS (1%) обаче води до увреждане на кожната бариера (B). Боята прониква в по-дълбоките слоеве на кожата (дермата). Този метод може да се използва и за изследване дали даден продукт може да възстанови бариерната функция след повреда.