Инхибиране на експресията на ген на ICAM-1 от олигонуклеотиди с тройна спирала - PDF Безплатно изтегляне
От клиниката и поликлиниката по дерматология и алергология към Университета „Лудвиг Максимилианс” в Мюнхен Директор: проф. Д-р мед. Д-р h.c. G. Plewig Инхибиране на експресията на гена ICAM-1 чрез олигонуклеотиди с тройна спирала Дисертация за придобиване на докторска степен по човешка биология в Медицинския факултет на Университета "Лудвиг Максимилианс" в Мюнхен, представена от Робърт Беш от Мюнхен 2003
С одобрението на Медицинския факултет на университета в Мюнхен Репортер: проф. Д-р К. Дегиц 2. Докладчик: проф. Д-р. P. B. Becker Съ-репортер: Надзор от служителя на доктора: Декан: Priv.-Doz. Г. Хартман проф. Д-р Th. Brocker Dr. C. маршал проф. Д-р Д-р h.c. К. Питър Ден на устния изпит: 28 юли 2003 г.
Инхибиране на експресията на гена ICAM-1 от олигонуклеотиди с тройна спирала
Части от тази работа са част от следната публикация: Besch, R., Giovannangeli, C., Kammerbauer, C., Degitz, K. Специфично инхибиране на експресията на ICAM-1, медиирано от генно насочване с триплекс-образуващи олигонуклеотиди J. Biol. Chem. 2002; 277: 32473-32479
Съдържание ВЪВЕДЕНИЕ 1. Откриване на структури с тройна спирала. 1 2. Генно инхибиране с олигонуклеотиди. 2 2.1 Генно инхибиране с олигонуклеотиди с тройна спирала. 2 2.2 Генно инхибиране с антисенс олигонуклеотиди. 3 3. Структура на тройната спирала. 4 4. Целеви последователности за олигонуклеотиди с тройна спирала. 5 5. Олигонуклеотиди с тройна спирала. 6 5.1 Основни аспекти при проектирането на олигонуклеотиди с тройна спирала. 6 5.1.1 Ориентация на базовите триплети. 6 5.1.2 Ъгли на свързване и дължини на тризнаци. 7 5.1.3 Свойства и стабилност на отделни основни тризнаци. 8 5.2 Олигонуклеотиди с тройна спирала. 8 5.2.1 Олигонуклеотиди с тройна спирала от пиримидинов тип. 9 5.2.2 Пуринови олигонуклеотиди с тройна спирала. 9 6. Модификации на олигонуклеотиди с тройна спирала. 10 6.1 Модификации на основите. 10 6.2 Модификации на гръбнака. 10 6.3 Модификации на краищата. 11 7. Технология с тройна спирала. 13 7.1 Биологична активност на олигонуклеотиди с тройна спирала. 13 7.2 Доказателства за образуване на тройна спирала. 14 1 Съдържание
8. Молекули на клетъчна адхезия. 14 суперсемейство имуноглобулин. 15 интегрини. 16 селектини. 16 кадрини. 17 9. Молекулата на клетъчната адхезия ICAM-1. 17 9.1 Възникване и регулиране на ICAM-1. 17 9.2 Имунологична функция на ICAM-1. 18 9.3 Медицинско значение на инхибирането на ICAM-1. 19 9.3.1 Възпалителни кожни заболявания. 20 9.3.2 Други възпалителни заболявания. 21 9.3.3 Защита срещу отхвърляне на трансплантирани органи. 21 9.4 Протеиновата структура на ICAM-1. 22 9.5 Генната структура на ICAM-1. 23 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ 1. Материали. 24 1.1 Химикали и разтворители. 24 1.2 Ензими. 25 1.2.1 Ограничителни ензими. 25 1.2.2 Други ензими. 25 1.3 Антитела. 25 1.4 Плазмиди. 26 1.5 Биологичен материал. 26 1.5.1 Прокариотни клетки. 26 1.5.2 Еукариотни клетки. 26 1.6 Среда и добавки за култивиране на еукариотни клетки. 26 2 Съдържание
1,7 олигонуклеотиди. 27 1.7.1 Тройна спирала и контролни олигонуклеотиди. 27 1.7.2 Олигонуклеотиди, използвани за получаване на целеви последователности 27 1.7.3 Олигонуклеотиди, използвани като праймери. 28 1.8 Пълни търговски системи. 29 1.9 Консумативи. 29 1.10 Устройства. 30 1.11 Софтуер. 30 2. Методи. 31 2.1 ДНК техники. 31 2.1.1 Общо боравене с нуклеинови киселини. 31 2.1.1.1 ДНК пречистване чрез фенолна екстракция. 31 2.1.1.2 Утаяване на ДНК. 31 2.1.1.3 Гел електрофореза с агарозни гелове. 31 2.1.1.4 Денситометрична оценка на ДНК ленти. 32 2.1.1.5 Изолиране на ДНК фрагменти от агарозни гелове. 32 2.1.1.6 Пречистване на ДНК със силикатни мембрани. 33 2.1.1.7 Определяне на концентрацията на нуклеинови киселини. 33 2.1.2 Приготвяне на геномна ДНК от клетки A431. 33 2.1.2.1 Приготвяне на геномна ДНК с анионообменни колони. 34 2.1.2.2 Приготвяне на геномна ДНК със силикатни мембранни колони. 34 2.1.3 Полимеразна верижна реакция. 2.1.4 Маркиране на нуклеинови киселини с дигоксигенин (DIG). 36 2.1.4.1 Вътрешно маркиране на нуклеинови киселини. 36 2.1.4.2 Маркиране на 3-те края на нуклеиновите киселини. 36 2.1.5 Трансфер на нуклеинови киселини към найлонови мембрани (попиване). 37 2.1.6 Хибридизация на ДНК с DIG-маркирани сонди (Southern blots). 37 2.1.7 Откриване на DIG-маркирани нуклеинови киселини. 37 3 Съдържание
2.5 Доказателства с тройна спирала. 51 2.5.1 Забавяне на гела. 51 2.5.2 Инхибиране на рестрикционните ензими. 52 2.5.3 Инхибиране на PCR реакция. 52 2.5.4 Откриване на тройни спирали чрез магнитно разделяне. 53 2.5.4.1 Откриване на тройна спирала върху изолирана геномна ДНК. 54 2.5.4.2 Откриване на тройна спирала в клетъчните ядра. 55 РЕЗУЛТАТИ 1. Целеви последователности за олигонуклеотиди с тройна спирала в гена ICAM-1. 56 1.1 Идентифициране на подходящи целеви последователности. 56 1.2 Избор на особено подходящи целеви последователности. 57 2. Проектиране на олигонуклеотиди с тройна спирала. 59 2.1 Олигонуклеотиди с тройна спирала за целевата последователност 13. 59 2.2 Олигонуклеотиди с тройна спирала за целевата последователност 17. 61 2.3 Дизайн на контролни олигонуклеотиди. 62 3. Изследвания на привързаността. 63 3.1 Изследвания на свързване с олигонуклеотиди с тройна спирала за целевата последователност 13. 63 3.1.1 Проучвания на свързване с целеви последователности на олигонуклеотиди. 63 3.1.2 Изследвания за свързване на плазмида. 65 3.1.2.1 Производство на плазмида pcm55 с целевата последователност 13. 65 3.1.2.2 Детекция на тройна спирала чрез инхибиране на EcoN I. 66 3.1.3 Изследвания за свързване на геномни ДНК препарати. 69 3.1.3.1 Инхибиране на рестрикционния ензим Bfa I. 69 3.1.3.2 Детекция на тройна спирала посредством магнитно разделяне. 70 3.1.4 Изследвания за свързване на препарати на клетъчно ядро. 72 3.2 Изследвания на свързване с олигонуклеотиди с тройна спирала за целевата последователност 17. 76 5 Съдържание
3.2.1 Изследвания за свързване на целеви последователности на олигонуклеотиди. 76 3.2.2 Изследвания за свързване на плазмиди. 79 4. Биологична активност на олигонуклеотиди с тройна спирала. 81 4.1 Инхибиране на експресията на ICAM-1. 81 4.1.1 Установяване на условия за трансфекция на олигонуклеотиди 81 4.1.2 Инхибиране на ICAM-1 от TFO13GT. 82 4.1.3 Инхибиране на ICAM-1 от btfo13cu. 86 4.1.4 Проучвания върху цитотоксичните ефекти. 87 4.2 Инхибиране на репортерни гени. 89 4.2.1 Клониране на репортерния плазмид. 89 4.2.2 Инхибиране на експресията на CAT и влиянието на UVA лъчението. 92 4.2.3 Допълнителни изследвания за доказване на тройно спирално медиирано генно инхибиране. 94 ДИСКУСИЯ 1. Свързваща способност на олигонуклеотиди с тройна спирала. 96 1.1 Проучвания върху олигонуклеотиди, съдържащи целеви последователности. 96 1.2 Изследвания върху плазмиди, съдържащи целеви последователности. 98 1.3 Проучвания върху геномна ДНК. 99 2. Инхибирането на ICAM-1. 102 3. Активността на олигонуклеотидите с тройна спирала в моделната система. 105 4. Влияние на UVA радиацията върху генното инхибиране с олигонуклеотиди с тройна спирала. 106 5. Outlook. 108 РЕЗЮМЕ. 110 СПИСЪК НА ЛИТЕРАТУРА. 113 ПРИЛОЖЕНИЕ. 126 6 Съдържание
9.5 Генната структура на ICAM-1 Генът ICAM-1 се състои от 7 екзона, които са прекъснати от 6 интрона (Фигура 11). Exon Intron Promoter 1 2 3 4 5 6 7 1000bp Фиг. 11: Генът ICAM-1. Пропорционално представяне на гена ICAM-1, с екзони, маркирани като номерирани кутии. Областите в първото и второто въведение, които не са били публикувани по време на писането, са маркирани с наклонени черти. Общата дължина на първия интрон е около 4 kb, вторият интрон е по-дълъг от 2,6 kb. Преведената област е показана в сиво, непреведени области в бяло. С изключение на няколко малки припокривания, всеки имуноглобулиноподобен домен на протеина е кодиран от един от приблизително 300 bp дълги екзони (Degitz et al. 1991). Извънклетъчните домени 1-5 съответстват на екзони 2-6, докато трансмембранната и вътреклетъчната част на протеина са кодирани от екзон 7 (Voraberger et al. 1991). Силната корелация между геномната организация и подразделянето на протеина на домейни е типично за имуноглобулиновото суперсемейство (Staunton et al. 1988). 23 Въведение
1.2 Ензими 1.2.1. (St.Leon-Rot) peqlab (Erlangen) Promega (Heidelberg) peqlab (Erlangen) Roche Diagnostics (Mannheim) 1.3 Рестрикционните ензими на антителата са получени от Roche Diagnostics (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), MBI Fermentas (St.Leon-Rot ) или получени от Hybaid-AGS (Хайделберг). Специфичност Специфичност Етикетиране Етикетиране Източник Източник Човешки ICAM-1 флуоресцеин изотиоцианат (FITC) MedSystems Diagnostics (Виена, Австрия) Човешки HLA-DR R-Phycoerythrin BD Biosciences (Хайделберг) (PE) Мишка IgG1 Fluorescein Isothiocialech-Couch-Loch-Couch Миши IgG1 R-фикоеритрин (PE) BD Biosciences (Хайделберг) 25 Материал и методи
1.4 Плазмиди Изходните плазмиди за клониране на репортерни плазмиди бяха pcat ™ -Basic и psv ™ -β-галактозидаза контрол (Promega, Heidelberg). ICAM-1 cDNA плазмид (pg4h1), състоящ се от pgem ™ -4Z (Promega, Хайделберг), в който фрагмент от 2980 bp от ICAM-1 cDNA е клониран с помощта на EcoR I и Sal I, идва от Staunton et ал. 1988. 1.5 Биологичен материал 1.5.1 Прокариотни клетки Escherichia coli (щам DH5α) бяха използвани за репликация на плазмид. 1.5.2 Еукариотни клетки Всички експерименти бяха проведени върху A431 клетки, получени от ATCC (Rockwille, Maryland, USA). 1.6 Среда и медийни добавки за култивиране на еукариотни клетки Име Наименование Амфотерицин B Модифициран орел на Dulbecco (DMEM) Фетален телешки серум (FCS) Hanks Буфериран солев разтвор (HBSS) L-глутамин Пеницилин Стрептомицин Трипсин (0.25%)/EDTA (1mM) Източник Източник Живот Технологии (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) ccpro (Neustadt/Weinstrasse) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) 26 Материал и методи
2.2 Олигонуклеотиди с тройна спирала за прицелна последователност 17 За прицелна последователност 17 бяха разработени антипаралелно свързващи олигонуклеотиди с тройна спирала от пуринов тип. Те се състоят от гуанин и аденин (TFO17GA, фигура 25 А) или от гуанин и тимин (TFO17GT, фигура 25 Б). А 3'-TEG TFO17GA GGGGGGAAGGGAGGAAG псорален С6 -5 ', 5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3' 3'-GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG-5 '3'-TEG B TFO17GT GGGGGGTTGGGTGGTTG псорален С6 -5', 5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3 '3'-GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG- 5 'Фиг. 25: Олигонуклеотидите с тройна спирала TFO17GT и TFO17GA. Фигура 25 А показва TFO17GA, който се свързва антипаралелно с пуриновата верига на целевата последователност 17, а Фигура 25 В показва TFO17GT, който също се свързва антипаралелно. И двата олигонуклеотида се свързват с двойната спирала с образуването на обратни водородни връзки на Hoogsteen. 5-те края са модифицирани с псорален, 3-те края с триетилен гликол. Тъй като 5 -TpA мястото е в 3-края на хомопуриновия сегмент, псорален е свързан с 5-края на олигонуклеотида с тройна спирала. Основният гуанин в олигонуклеотида с тройна спирала се добавя към 5-ия край, за да се приведе псорален в позиция, подходяща за интеркалация. Свободните 3 края бяха модифицирани с триетилен гликол. 61 резултата
2.3 Проектиране на контролни олигонуклеотиди Олигонуклеотидите със смесена последователност, които имат същата дължина и същият основен състав като съответните олигонуклеотиди с тройна спирала (разбъркан контрол), служат като контроли. Внимава се да се гарантира, че разпределението на основите е възможно най-подобно на свързаните олигонуклеотиди с тройна спирала. За олигонуклеотида с тройна спирала btfo13cu, който може да се свързва само в паралелна ориентация, като контрола е проектиран олигонуклеотид с обърната последователност (3 и 5 края се разменят). В допълнение към същия състав, обърнатите олигонуклеотиди имат също същото разпределение на основите. Те бяха маркирани с инв (за обърнати). Внимава се също така, че модификациите на контролните олигонуклеотиди съответстват на тези на олигонуклеотидите с тройна спирала. Аналогично на олигонуклеотидите с тройна спирала, беше гарантирано, че контролните олигонуклеотиди не са способни да хибридизират с ICAM-1 иРНК (антисенс ефекти). Последователността на всички контролни олигонуклеотиди със съответните олигонуклеотиди с тройна спирала, за които са използвани, е показана в раздела за материали (раздел 1.7.1, страница 27). 62 резултата
Ако TFO17GA се инкубира с плазмида pg4h1 в (безкалиев) инкубационен буфер и се облъчи, инхибирането на PCR реакцията се открива от 100-кратен моларен излишък на олигонуклеотид с тройна спирала. По-нататъшното увеличаване на количеството TFO не доведе до по-голямо инхибиране. Трябва да се отбележи, че PCR реакцията се предотвратява само ако и двете ДНК вериги са омрежени (бисадукти), тъй като в случая на моноадукти противоположната верига на PCR амплификацията все още е налична. Следователно пълното PCR инхибиране на реакционната смес е малко вероятно. Ако инкубацията се проведе в калий-съдържащ буфер, се наблюдават подобни резултати, като инхибирането се открива само от 1000 пъти излишък от TFO. Този резултат също се съгласува с намаленото образуване на тройна спирала в експериментите с забавяне на гела в присъствието на калий. PCR реакцията не се инхибира без облъчване. Сравнението на плазмидните ленти показа, че количеството на използвания плазмид е приблизително еднакво във всички партиди и че разликите в количеството на PCR продукта се основават на PCR инхибиране, а не на различни количества плазмид, използван. 80 резултата
4.1.3 Инхибиране на ICAM-1 от btfo13cu След като експресията на ICAM-1 беше инхибирана от антипаралелно свързващия олигонуклеотид с тройна спирала TFO13GT, бяха проведени експерименти с паралелно свързване btfo13cu. Този олигонуклеотид също има инхибиращ ефект върху ICAM-1 (Фигура 47). ICAM-1 HLA-DR A нелекуван E нетретиран B IFNγ F IFNγ C btfo13cu G btfo13cu D bcoinvcu H bcoinvcu Фиг. 47: HLA-DR експресия и ICAM-1 експресия на A431 клетки след трансфекция с btfo13cu. Вляво е показано оцветяването с маркирано с FITC анти-ICAM-1 антитяло, вдясно оцветяването с РЕ-конюгирано анти-HLA-DR антитяло. Клетките бяха или нетретирани (Фигура 47 A и E), третирани с IFNγ (Фигура 47 B и F) или трансфектирани с 2 µm btfo13cu (Фигура 47 C и G) или 2 µm bcoinvcu (Фигура 47 D и H) преди третиране с IFNγ са били. 86 резултата