Имуномагнитно разделяне на специфични за мастните депа протоколи Sca1high, произведени от мастни клетки (ASC) Протокол

Въведение

В областта на затлъстяването и диабета, фиброзата и възпалението на тъканите играят решаваща роля в развитието и поддържането на диабет тип 2. Наскоро Tokunaga et al. показа, че от ингвинални изолирани висококлетъчни Sca1 (или подкожни, SQ) и перигонадални (или висцерални, VIS) 10 различни генни сигнатури и ECM ремоделиране in vitro C57BL6/J мастни депа. MMP14 (MT1-MMP), прототипен член на семейството на мембранния тип матрица-металопротеиназа (MMP), медиира развитието на бяла мастна тъкан (WAT) чрез своята колагенолитична активност 1.

Примери за експерименти, които могат да бъдат извършени с клетките по следния протокол, включват триизмерна култура, изследвания на диференциация, анализи за разграждане на колаген и RNA секвениране 10,11 изолирани и обогатени. Анализите на разграждането трябва да се извършват с екстрахиран с киселина колаген, за да се осигури запазването на телопептид 11,12. Следващият протокол ще демонстрира методите за изолиране на съдови строми на първични клетки от различни мастни натрупвания и обогатяването им в адипоцитни родословни клетки, като се използва имуномагнитно клетъчно разделяне. Валидността на клетъчното сортиране може да бъде оценена с поточна цитометрия и чрез използването на Sca1-GFP - мишки, които експресират GFP в клетки Sca1 +, задвижвани от промотор на Sca1 13.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Декларация за етика: Комитетът по използване и грижи за животните към Университета в Мичиган (UCUCA) одобри всички методи и протоколи в съответствие с ръководството за грижи и употреба на лабораторни животни (Институт за лабораторни изследвания на животните, Национален съвет за изследвания). Мишките са настанени във вивариум на Университета на Мичиган и им се предоставя свободен достъп до храна и вода и се държат на 12-часов цикъл светлина/тъмнина.

2. Изолиране на подкожни (SQ) мастни накладки

  1. Евтаназирайте мишката с предозиране на изофлуран и пневмоторакс.
  2. Внимателно напръскайте мишката със 70% етанол и легнете по гръб. Прикрепете лапите към дъската с пяна с игли 22 G.
  3. Направете малък разрез в кожата на корема. Придържайки върха на разреза с форцепс, вземете ножицата и отделете кожата, преди да отделите перитонеума.
  4. След като кожата се отдели от перитонеума от корема до гръдния кош, кожата се отразява от перитонеума към главата чрез странични прорези в кожата по страничната част на тялото.
  5. Огледайте останалата кожа в слабините, като държите мазнината далеч от тялото ви, и закрепете върху чинията с 22 G игли.
  6. Преминете към фини ножици и пинсети. Хванете ингвиналната мастна подложка с форцепс в началото в близост до перитонеума и откъснете между кожата и ингвиналната мазнина към слабините напред, избягвайки SQ да замърси кожата.
  7. Поставете изолираната ингвинална мастна подложка в определената тава за 60 mm.

3. Изолиране на висцерални (VIS) мастни подложки

  1. По подобен начин на стъпка 2.5, разрежете перитонеума, за да разкриете висцералната мазнина и добре.
  2. Преместете червата далеч към гръдния кош.
  3. Хванете VIS мастната подложка на дисталния край и внимателно я издърпайте нагоре. Дисектирайте мастната подложка на VIS, като внимателно изключвате епидидимална (или маточна, ако се използват женски мишки) тъкан.
  4. Поставете в тавата за етикети и повторете стъпка 3.3 за останалата подложка на VIS.

4. Колагеназно усвояване на мастните натрупвания

6. Проверка на имуномагнитното разделяне на Sca1 високи ACS с помощта на поточна цитометрия

  1. Изплакнете клетките два пъти с HBSS (-Ca, -Mg) и дисоциирайте клетките, използвайки 0,05% трипсин.
  2. Центрофугирайте клетки при 300 х g за 5 минути. Поставете клетките в 1 ml хранителна среда и пребройте камерата за преброяване.
  3. Получават се> 10 6 клетки в 1 ml хранителна среда и се центрофугират при 300 g за 5 минути.
  4. Отстранете супернатантата и повторете стъпка 6.3 още два пъти.
  5. Клетките с 1 ml 2% кози серум + 2% BSA и се блокират за 30 минути при RT.
  6. Центрофугирайте клетки при 300 х g за 5 минути.
  7. Премахнете блокираното решение.
  8. Добавете IgG2a плъх Alexa Fluor 647 (0,25 µg, 1: 400) или анти-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 µg, 1: 400), в 100 µg. 1 PBS с 2% кози серум и 2% BSA + PBS при 4 ° C за 30 минути на тъмно.
  9. Добавете 1 ml студен PBS към клетките. Центрофугирайте 300 xg за 5 минути при 4 ° C.
  10. Отстранете супернатантата и повторете стъпка 6.9 още два пъти.
  11. Клетките в 1 ml PBS. Прекарайте клетъчни суспензии през 100. m Клетъчно сито в подготовка за поточен цитометричен анализ.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Натрупване на Sca1 високи ASCS от различни мастни подложки.

Съдовите стромални клетки, изолирани от SQ мазнини, показват фибробластоподобна, удължена клетъчна форма, независимо от нивото на експресия на Sca1 (Фигура 1А). От друга страна, VIS (получени от EWAT) Sca1 високи и Sca1 ниски клетки показват забележими разлики във формата им. Подобно на SQ (получени от iWAT) Sca1 високи клетки, VIS (получени от EWAT) Sca1 високи клетки показват удължена, подобна на фибробласт клетъчна форма, докато VIS Sca1 ниските клетки показват епителиоидна форма. Високи клетки на SCA1, изолирани от мишки SCA1-GFP, лесно се идентифицират като GFP-положителни клетки в тъканната култура (1B) идентифицирани. Когато тези клетки бяха оценени с помощта на цитометричен поток, повечето от GFP положителните клетки бяха потвърдени да експресират Sca1 протеини на клетъчната повърхност, както се открива с Ti-Sca1 антитяло (1С). Висококачествените клетки на Sca1, получени от ингвинални мастни накладки, поддържат капацитета на адипоцитите - диференциацията се увеличава, докато получените от EWAT високи клетки Sca1 са по-трудни за диференциране с конвенционалната адипогенна смес в адипоцитите.

Експресия на гени, зависими от депата на мазнини на Sca1 High ASCS (Фигура 2).

Широкогеномни транскриптомни анализи с РНК секвениране показват обогатяване на гени във връзка с извънклетъчни матрични протеини и модификатори (GO: 0.031.012, GO: 0005578) в тези Sca1 високи ASCS 10. Във връзка с PCR анализи в реално време успяхме да открием различните Изразяване на колагенолитични MMP (MMP-2, MMP8, MMP13, MMP14) между i1WAT и EWAT, получени Sca1, за да се демонстрира висок ASCS. Когато се използват маркирани с флуоресценция колагенови гелове от тип I, за да могат да се оцени перицелуларната разградителна активност, наблюдаваме значително повишената активност за ремоделиране на колаген, медиирана от VIS Sca1 висок ASCS 10.

депа
Фигура 1: Имуномагнитно разделяне на миши Sca1 високо ASCS от различни мастни натрупвания (А) Sca1 висок и Sca1 нисък ASCS, изолирани от SQ (iWAT) и VIS (EWAT). Скала = 100 µ м. (Б) Sca1-GFP клетки, изолирани от iWAT от мишки Sca-GFP. Скала = 100 µ м. (° С) Експресията на клетъчната повърхност на Sca1 в Sca1-GFP-положителни клетки се оценява с помощта на поточна цитометрия. (Вляво) контролни IgG от плъх анти-Sca1 антитела. Оста X, интензитет на GFP. Оста Y, Alexa-Fluor 647. Панел A, показан преди това в Tokunaga, M. et al., (2014) .ig1large.jpg "target =" _ blank "> Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

депа
Фигура 2:. Експресия на колагенолитични MMPs, TIMPs и колагени, зависима от мастните депа (А) Диференциална генна експресия на ECMs и ECM модификатори в Sca1 високо ASCS, изолирани от различни мастни натрупвания. (Б) повишена активност на разграждане на колаген на VIS (получена от EWAT) Sca1 с висок ASCS. Разграждането на колагена се показва като изчезване на флуоресцентни сигнали (стрелки и върхове на стрелки). Inset е увеличено изображение на фокусирано разграждане на колаген, медиирано от единична клетка на SQ ASCS. Клетките се култивират в продължение на 72 часа. Данните, показани по-рано в Tokunaga, M. et al., (2014). Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Тук показваме изолирането и имуномагнитното клетъчно отделяне на миши ASCS от различни мастни накладки и тяхното използване за експериментите in vitro. Представеният метод е ефективен за бърза изолация на голям брой Sca1-положителни ASCS, което е предимство пред технически сложната и скъпа FACS-медиирана изолация на ASCS 9,14. За разлика от FACS, имуномагнитното клетъчно разделяне не позволява използването на множество антигени за идентифициране на целевата клетъчна популация. Независимо от това, ако повърхностният антиген е добре охарактеризиран, използването на имуномагнитно разделяне увеличава броя на клетките, без да се разчита на използването на FACS устройства 15, които все още не са лесно достъпни в малки институти без основни съоръжения за анализ на много биологични изследователи .

Докато Sca1 не се открива в човешкия геном, идентифицирането и валидирането на алтернативни антигени на клетъчната повърхност на зависимите от мастните депа стволови клетки на човешката мастна тъкан, когато се съчетае с тази техника за разделяне на клетките, може да ни помогне да определим биологията на стволовите клетки на човешката мастна тъкан.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Разкриване

Авторите няма какво да разкрият.

Благодарности

Тази работа се поддържа от NIH DK095137 (THC). Благодарим на настоящите и бивши членове на лабораторията, които допринесоха за развитието и усъвършенстването на описаните процедури.