IgG - ttg - Имунен отговор при диабет тип 1 с цьолиакия - PDF безплатно изтегляне
Университетска болница Улм Център за вътрешни болести Клиника по вътрешни болести I Медицински директор: Проф. Д-р Guido Adler Фокус върху ендокринологията, диабета и метаболизма проф. Д-р мед. Bernhard O. Böhm IgG - ttg - имунен отговор при диабет тип 1 с целиакия Дисертация за придобиване на докторска степен по дентална медицина в Медицинския факултет на Университета в Улм, представена от Тимо Кноче Бьоблинген 2010 I
Изпълняващ длъжността декан: проф. Д-р Клаус-Михаел Дебатин 1-ви докладчик: проф. Д-р Бернхард Ото Бьом 2-ри репортер: проф. Д-р Д-р Петер Керн: 22 април 2010 г. II
Съдържание Списък на съкращенията 1. Въведение 1 1.1 Дефиниция на целиакия 1 1.2 История 2 1.3 Епидемиология и патогенеза на цьолиакия 4 1.4 Форми на цьолиакия 8 1.5 Целиакия и други болести 12 1.6 Брой 16 2. Материал и метод 17 2.1 Реактиви, разтвори и буфери 17 2.2 Устройства и консумативи 19 2.3 Пациентски серуми 20 2.4 Определяне на титъра 21 2.4.1 Определяне на ttg-iga титъра 21 2.4.2 Определяне на ttg-igg титъра 29 3. Резултати 30 3.1 Определяне на ttg-iga титъра 30 3.2 Определяне на ttg-igg титъра 32 3.3 Пряко сравнение на ttg-igg с ttg-iga титри 34 3.4 Изчислително сравнение на титри/статистически резултати 38 IV
4. Дискусия 43 5. Резюме 52 6. Библиография 53 Приложение V
Списък на съкращенията AGA антитела срещу глиадин APC антигени, представящи клетъчен BSA говежди серумен албумин CD клъстер за диференциация DR, DQ HLA генни локуси на хромозома 6 DZG Deutsche Zöliakie Gesellschaft e.v. ELISA Ензим свързан имуносорбентен анализ ЕМА Endomysium Антитела ESPGHAN Европейския общество за детска Gastroenterology, Hepatology и хранене GFD глутен диета, без глутен диета H 2 SO 4 сярна киселина HLA антигени човешки левкоцитен IFN Интерфероните IgA имуноглобулин тип А IgE Имуноглобулин Тип Е IgG Имуноглобулин Тип G IgM имуноглобулин от тип M IL Интерлевкин MHC Основен комплекс за хистосъвместимост ml Милилитър MMP Матрица Металопротеинази mrna пратеник Рибонуклеинова киселина PBS Фосфат Буфериран физиологичен разтвор TGF Тумор Растенен фактор TMB Tetramethylbenzidine TNF Тумор Tumer Tgis Tigum Tgis Tigum Tigum Tg Tigum Tg Tigum Tgg; произволна, произволна единица VI
- Контролна биопсия, показана в случай на съмнителен клиничен успех с безглутенова диета - Излагане на глутен с биопсия, посочена в: - Съмнения относно първоначалната диагноза - Диагноза на възраст 30/100 епителни клетки) и нормална лигавична архитектура, хиперпластичен тип II, с хиперплазия на крипта, увеличени интраепителни лимфоцити и нормални вили и деструктивния тип III с 3 подтипа а до с, който показва закръглено или сплескване на ворсинките, хиперплазия на криптите, увеличени интраепителни лимфоцити и възпалителен инфилтрат в ламина проприа (DZG 2009) 11.
Ендомизиевите антитела в нормални граници, както и биопсията на Дуденал показват нормална картина. Пациентите със селективен дефицит на IgA имат 10 пъти по-висок риск от развитие на цьолиакия. Синдромът на Шегрен, косопадът и болестта на Адисън са други разстройства, които могат да бъдат свързани с цьолиакия. Рискът от лимфом в тънките черва е най-голям при пациенти, които са диагностицирани с целиакия в зряла възраст. Ракът на фаринкса и хранопровода също може да се открие по-често при пациенти с целиакия. Най-новите проучвания от 2004 г. обаче показват, че съществува само умерено повишен туморен риск и че спазването на строг GFD води до адаптиране на риска към общата популация в рамките на 5-10 години (Mäki and Collin 1997, DZG 2009). 15-ти
1.6 Проблем С въвеждането на серологичната диагностика и откриването на антитела, разпространението нараства бързо. Стана ясно, че пациентите с целиакия, записани чрез биопсия, са само върхът на айсберга. Недостатъците на тестовете за тъкани, тестовете за ендомизий и ретикулин са високите разходи и ограниченото количество субстрат, който трябва да се получи от маймунския хранопровод. Освен това за провеждането на тези тестове се изисква специално обучен персонал, тъй като тестовете са технически много сложни. (Mäki and Collin 1997). След идентифицирането на антигена ttg могат да бъдат разработени специфични тестови комплекти за количествено откриване на антителата. Тестове като Elisa не само улесниха първоначалната диагноза, но и последващата диагностика и контролната диагноза. Общите тестове използват антигена ttg за откриване на IgA и IgG антитела. Тази теза се фокусира върху разпределението на IgA и IgG анти-tTG-Ab в контекста на диабет тип 1. Целта е да се провери дали резултатите позволяват да се правят изводи за имунологичния процес и дали от това може да се постигне подобрение в диагностиката. 16.
2. Материал и методология 2.1 Реактиви, разтвори и буфери Celikey IgG PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Germany) GmbH) Тъканен трансглутаминаза (човешки, рекомбинантен) IgG анализ на антитела за in vitro диагностика Микротитърни ленти (17996), покрити с човешки, рекомбинантен ttg антиген 6 ttg ( IgG) стандартни разтвори на антитела в концентрации 0 3 7 16 40-100 U/ml в PBS с BSA 0,095% (w/v) натриев азид 1 положителна контрола с BSA, 0,095% (w/v) натриев азид, детергент и човешки серум в PBS 1 отрицателен контрол с BSA, 0,095% (w/v) натриев азид, детергент и човешки серум в PBS концентрат за промивен буфер 20x PBS концентрат с 0,095% (w/v) натриев азид и детергент за проба с BSA, 0,095% (w/v) натриев азид и детергент, оцветен жълт IgG конюгат, античовешки IgG пероксидаза, оцветен червен Ензимен субстрат TMB (3, 3, 5, 5, тетраметилбензидин) стоп разтвор, 0,5 MH 2 SO 4, безцветен 17
Celikey PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Germany) GmbH) Тъканен трансглутаминаза (човешки, рекомбинантен) IgA анализ на антитела за in vitro диагностика Микротитърни ленти (18196), покрити с човешки, рекомбинантен ttg антиген 6 ttg (IgA) антитела Стандартни разтвори в концентрации 0-3- 7-16-40-100 U/ml в PBS с BSA 0,095% (w/v) натриев азид 1 положителна контрола с BSA, 0,095% (w/v) натриев азид, детергент и човешки серум в PBS 1 отрицателна контрола с BSA, 0,095% (тегл./Об.) Натриев азид, детергент и човешки серум в концентрат за промивен буфер PBS 20x концентрат PBS с 0,095% (тегл./Об.) Натриев азид и детергент Пробен буфер с BSA, 0,095% (тегл./Об.) Натриев азид и препарат, оцветен жълт конюгат IgA, Античовешка IgA пероксидаза, оцветен червен ензимен субстрат TMB (3, 3, 5, 5, тетраметилбензидин) стоп разтвор, 0,5 MH 2 SO 4, безцветен 18
2.2 Устройства и консумативи Eppendorf Hamburg - Пипетна справка - Multipipette Multipette plus - Combitipp 1,0 ml, 2,5 ml, 5,0 ml Sarstedt Nümbrecht - Накрайници за пипета жълти 10 100 µl - Накрайници на пипети сини 100 1000 µl Vortex - Shaker Genie Ampuwa - Дестилирана Water SLT - Устройство за измерване на микротитърни плочи Spectra Epson - принтер LX-400 Друго - конвенционален персонален компютър, MS Word 2003, MS Excel 2003 - Synelisa Software Ver. 3.2 юли 1995 г. - Статистически програми за статистика Winstat и PASW 18 19
2.3 Пациентски серуми Използвани са пациентски серуми, за които IgA титрите вече са налични. Избрани са онези серуми, които имат IgA титър по-висок от 8 U/ml, за да се избегнат граничните положителни серуми (сива зона). От популация от 803 пациенти с диабет тип 1, 73 IgA положителни серума от 44 жени и 26 пациенти от мъжки пол са избрани за определяне на IgA и IgG титрите. Полът не може да бъде зададен в 3 проби. Възрастта на пациентите варира от 4 до 84 години. 25 от пациентите имат IgA титър по-голям от 100 U/ml. Серумите на тези пациенти са изследвани допълнително с подходящите разреждания, за да се определят количествено титрите на антителата. Таблица 1: Преглед на популацията, N = Брой Брой Възраст N Мъжки Жени Неизвестен обхват Проучване 1 59 20 38 1 4 84 Проучване 2 14 6 6 2 11 83 20
23 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Фигура 2: Стандарти на схемата за пипетиране: черен контрол: бял +/- пациенти: бял, номериран
2.4.1.3 Графично представяне на тестовата процедура = човешки, рекомбинантен тъкан трансглутаминазен антиген като твърда фаза Фигура 3: Схематична настройка на теста 1 от 10 пипетиране на серумните проби = тъканно трансглутаминазно антитяло, = човешки, рекомбинантен тъкан трансглутаминазен антиген като твърда фаза = други клетъчни компоненти
= Тъканно трансглутаминазно антитяло, = човешки, рекомбинантен тъкан трансглутаминазен антиген като твърда фаза = други клетъчни компоненти 1-ва реакция: Тъканните трансглутаминазни антитела, присъстващи в серума на пациента, се свързват с антигените. Инкубирайте за 30 минути. Антитела, = човешки, рекомбинантен тъкан трансглутаминазен антиген като твърда фаза = други клетъчни компоненти Фигура 6: Схематична настройка на теста 4 от 10 25
Пипетиране в конюгата на анти-човешка пероксидаза = конюгат на анти-човешка пероксидаза = антитяло на трансглутаминазна тъкан = човешки, рекомбинантен антиген на трансглутаминаза като твърда фаза като твърда фаза 2-ра реакция: конюгатът се комбинира с комплекса антиген-антитяло Инкубирайте в продължение на 30 минути Фигура 8: Схема на експериментална настройка 6 от 10 26
3 x измиване от кухината с промивен буфер = конюгирана анти-човешка пероксидаза = тъканна трансглутаминазна антитела = човешка, рекомбинантна тъканна трансглутаминазна антиген като твърда фаза, рекомбинантен тъкан трансглутаминазен антиген като твърда фаза = тетраметилбензидин Фигура 10: Схематична експериментална настройка 8 от 10, TMB = тетраметилбензидин 27
= Конюгирана анти-човешка пероксидаза = тъканна трансглутаминазна антитела = човешка, рекомбинантна тъканна трансглутаминазна антиген като твърда фаза = тетраметилбензидин инкубира в продължение на 10 минути на тъмно Твърда фаза = тетраметилбензидин H 2 SO 4 = тетраметилбензидин след промяна на цвета 3-та реакция: -Ензимираните с ензими комплекси конюгат-антитяло-антиген настройват субстрата да променя цвета на субстрата от червен на жълт -реакцията се спира със сярна киселина -30 минути след спиране може да бъде фотометрична при 450 nm се определят оптичните плътности Фигура 12: Схематична експериментална настройка 10 от 10, H 2 SO 4 = сярна киселина 28
Таблица 2: Тест на Колмогоров-Смирнов за нормално разпределение с корекция на значимостта според Lilliefors за ttg (iga) и ln [ttg (iga)], ttg (iga) = антитела от тип А срещу тъканната трансглутаминаза, ln = логаритъм към база e, n = число Колмогоров-Смирнов n Значение ttg (iga) 73 000 ln [ttg (iga)] 73.032 Фигура 13: Хистограма на абсолютните стойности на титъра на ttg (iga) с нормална крива на разпределение, ttg (iga) = антитела от тип А срещу тъканната трансглутаминаза Фигура 14: Хистограма на логаритмичната Стойности на титъра за база e на ttg (iga) с нормална крива на разпределение, ln = логаритъм за база e, ttg (iga) = антитела от тип А срещу тъканна трансглутаминаза 31
Фигура 15: Хистограма на абсолютните стойности на титъра на ttg (igg) с нормална крива на разпределение, ttg (igg) = антитела от тип G срещу тъканна трансглутаминаза Фигура 16: Хистограма на логаритмизираните стойности на титъра за база e на ttg (igg) с нормална крива на разпределение, ln = логаритъм до база e, ttg (igg) = антитела тип G срещу тъканна трансглутаминаза 33
3.3 Пряко сравнение на ttg-igg с ttg-iga титри При пряко сравнение на резултатите от ttg-iga и ttg-igg определянето на титъра и сравнителното графично представяне на титрите на изпитвания субект става очевидно следното: 93% (69 от 73) от пробите имат IgA титър над този на IgG; при 7% от тях (5 от 69) стойността е значително по-висока от тази на IgG (вж. фигура 17-24). В 7% (5 от 73) от пробите обаче IgG титърът е по-висок от този на IgA (виж Фигура 17-24). Когато се разглеждат стълбовидните графики на IgA и IgG в сравнение, може да се види следното: - Стойностите на IgA и IgG не корелират помежду си, т.е. H. висок ttg-iga титър не води до висок ttg-igg титър. - По същия начин ниският IgA титър не е свързан с нисък IgG титър и обратно. - От друга страна, ако IgG титърът е висок, IgA титърът също е висок. ttg IgA-IgG титър в сравнение 900 800 700 600 500 титър 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 номер на пробата ttg (IgA) ttg (IgG) Фигура 17: ttg IgA-IgG титър в сравнение, проба номер 1 -10, ttg (IgA) = антитела от тип А срещу тъканна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела от тип G срещу тъканна трансглутаминаза 34
ttg IgA-IgG титър в сравнение 400 350 300 250 титър 200 150 100 50 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Номер на пробата ttg (IgA) ttg (IgG) Фигура 18: ttg IgA-IgG титър в сравнение, номер на проба 11- 20, ttg (IgA) = антитела от тип А срещу тъканна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела от тип G срещу тъканна трансглутаминаза ttg IgA-IgG титър в сравнение 500 450 400 350 300 титър 250 200 150 100 50 0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Номер на пробата ttg (IgA) ttg (IgG) Фигура 19: ttg IgA-IgG титър в сравнение, номер на проба 21-30, ttg (IgA) = антитела от тип А срещу тъканна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела от тип G срещу тъканна трансглутаминаза ttg IgA-IgG титър в сравнение 1000 900 800 700 600 титър 500 400 300 200 100 0 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 номер на пробата ttg (IgA) ttg (IgG) Фигура 20: ttg IgA-IgG титър в сравнение, Проба номер 31-40, ttg (IgA) = антитела от тип А срещу тъканна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела от тип G срещу тъканна трансглутаминаза 35
ttg IgA-IgG титър в сравнение 300 250 200 титър 150 100 ttg (IgA) ttg (IgG) 50 0 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 номер на пробата Фигура 21: ttg IgA-IgG титър в сравнение, номер на проба 41-50, ttg (IgA) = антитела от тип А срещу тъканна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела от тип G срещу тъканна трансглутаминаза ttg IgA-IgG титър в сравнение 1400 1200 1000 титър 800 600 400 200 0 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 номер на пробата ttg (IgA) ttg (IgG) Фигура 22: ttg IgA-IgG титър в сравнение, номер на проба 51-60, ttg (IgA) = антитела от тип А срещу тъканна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела от тип G срещу тъканна трансглутаминаза ttg IgA- IgG титър в сравнение 400 350 300 250 титър 200 150 100 50 0 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 номер на пробата ttg (IgA) ttg (IgG) Фигура 23: ttg IgA-IgG титър в сравнение, номер на проба 61-70, ttg (IgA) = антитела от тип А срещу тъканна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела от тип G срещу тъканна трансглутаминаза 36