Идентифициране на протеини с киназна активност - Човек - Храна - Околна среда

принцип

Човешки фосфо-MAPK масив и -RTK масив за определяне на относителни нива на фосфорилиране на активирани митоген-активирани протеинкинази (MAPK), тирозин кинази (RTK) и други серин/треонин кинази

Сред каскадите на вътреклетъчната трансдукция на сигнала киназите на активирания от митогена

Човешки набор от фосфо-MAPK масив за откриване на множество фосфорилирани кинази в третирани, както и нетретирани клетки.

Семейство протеин киназа (MAPK) играе централна роля. Семейството MAPK комбинира редица серин/треонин кинази, като например ERK-1 (p44MAPK), ERK-2 (p42MAPK), юни N-терминални кинази и p38-MAPK. Стимулиране на клетката чрез напр. Митогенните фактори обикновено водят до увеличаване на активността на MAP киназата. ERK-1 и -2 напр. след това се транслоцират в клетъчното ядро и активират транскрипционни фактори, което впоследствие води до клетъчна пролиферация или клетъчна диференциация, докато инхибирането на MAPK инхибира тези процеси. С конститутивното активиране на тези кинази може да настъпи неконтролиран клетъчен растеж, който играе важна роля в туморогенезата. По същия начин повишената активност на ERK е свързана с повишен туморен потенциал за инвазивност и метастази.

Тези кинази могат да бъдат активирани от различни рецепторни лиганди, при което медиираният от рецептор тирозин киназа механизъм на ERK1/2 активиране е добре характеризиран. Рецепторните тирозин кинази (RTK) са важни медиатори на физиологичните клетъчни процеси като пролиферация, диференциация, подвижност или регулиране на клетъчното оцеляване. RTK включва рецептора за епидермален растежен фактор (EGF) и инсулиновия рецептор. Когато рецепторен лиганд се свързва със специфичното място на свързване на RTK, има промяна в конформацията и последваща димеризация на рецептора. Това води до трансфосфорилиране на двата мономера. Фосфорилираните тирозинови остатъци от активирания рецептор образуват докинг точка за протеини-адаптери, които след това са в състояние да инициират протеинкиназна каскада. Този принцип може да се наблюдава и при други рецепторни тирозин кинази.

С помощта на човешкия фосфо-MAPK масив и човешкия фосфо-RTK масив може да се измери състоянието на фосфорилиране на голям брой сигнални молекули, както и фосфорилирането на рецептора в процеса на трансдукция на сигнала. Предимството на тези масиви е големият брой записани MAP кинази и RTK:

Записан MAPK (21 MAPK):

ERK1, ERK2, JNK1, JNK2, JNK3, JNK-pan, p38-α, p38-b, p38-g, p38d, RSK1, RSK2, GSK-3a, GSK-3b, Akt1, Akt3, Akt2, Akt pan, MSK1, MSK2, HSP27, p70 S6 киназа

Заловено RTK (42 RTK):

EGFR, ErbB2, -3, -4, FGFR1, -2a, -3, -4, InsulinR, IGF1-R, Axl, Dtk, Mer, HGFR, MSPR, PDGFRa, -ß, SCFR, Flt-3, MCDFR, c-Ret, ROR1, -2, Tie-1, -2, TekA, -B, -C, VEGFR1, -2, -3, MuSK, Epha1-7, EphB1-6

Принцип на измерване

Специфичните за киназа антитела се забелязват като дублети върху нитроцелулозна мембрана и се инкубират с приготвения клетъчен лизат, като фосфорилираните кинази се свързват с петнистите антитела. За откриване на всяко място се пипетира „коктейл“ от антитела срещу 21 специфични кинази, към края на които е свързан биотин. За всяко петно се създава многослоен слой от имобилизирани антитела, киназа и комплексът антитяло-биотин под формата на „молекулен сандвич“. Тогава действителната реакция на откриване се осъществява чрез добавяне на стрептавидин-HRP и откриване на хемилуминесценцията.

Опитна оценка

Клетките се третират със субстрата за 15 минути или не се третират. След приготвяне на клетъчния лизат и инкубация с антителата, откриването се извършва чрез хемилуминесценция. След това дигитализираните изображения се оценяват денситометрично и интензитетът на пикселите се показва графично.

разходи

Прибл. 380 € за 4 проби за едновременно определяне на 21 MAPK

Прибл. 450 € за 4 проби за едновременно определяне на 42 RTK

Пример за приложение (общо)

Регулаторно влияние на хранителните съставки върху фосфорилирането на сигнални протеини или рецептори в контекста на имунния отговор (Wang et al. 2007 и Stehphen et al. 2007), както и влиянието на млечните олигозахариди върху процесите на преобразувателя на сигнала (Kuntz et al. 2009).