Идентифициране на MyoD Interactome с помощта на тандемно афинитетно пречистване, свързано с масспектрометрия

Резюме

Въведение

MyoD се счита за основен играч в задействането на терминална диференциация на мускулите 9, тъй като има способността да индуцира програма за миогенно определяне/диференциация (транс-диференциация) в много напълно диференцирани немускулни системи 10-13. Всъщност принудителната експресия на MyoD индуцира транс-диференциацията на различни клетъчни типове, дори тези, идващи от друг ембриологичен произход 12. Например, MyoD може да конвертира хепатоцити, фибробласти, меланоцити, невробласти и адипоцити в подобни мускулни клетки. Трансдиференциращото действие на MyoD включва необичайно активиране на миогенната генетична програма (по-специално нейните целеви гени) в немускулна среда, едновременно със заглушаването на оригиналната генетична програма (по-специално гените за пролиферация).

При пролиферацията на миобласти MyoD се експресира, но не е в състояние да активира своите целеви гени, дори когато се свързва с техните 14-16 промотори. Следователно, изискването MyoD да се изразява непрекъснато в недиференцирани миобласти остава доста неуловимо. MyoD успя да репресира целевите си гени поради набиране на репресивни ензими, модифициращи хроматин в пролиферацията на миобласти преди зареждане, за да активира ензимите за ремоделиране на хроматин 14,17. Например, при миобластната пролиферация MyoD се свързва с транскрипционния ко-репресор KAP-1, хистонови деацетилази (HDAC) и лизин, репресиращи метилтрансферази (Kmts), включително хистон H3 лизин 9 или H3K9 и H3K27 Kmts и активно потиска експресията на целеви гени чрез установяване на локално репресивна хроматинова структура 14,17. Важното е, че неотдавнашен доклад показва, че MyoD самият е директно метилиран от H3K9 KMT G9a, което води до инхибиране на неговата трансактивационна активност 16.

Епигенетичните механизми, участващи в тази транс-диференциация на немускулни клетки от MyoD, са до голяма степен неизвестни. По-специално, някои клетъчни линии са устойчиви на индуцирана MyoD-транс-диференциация. По този начин, в клетките HeLa, MyoD е неактивен или дори може да функционира като репресор, а не като активатор на транскрипция поради липсата на експресия на субединицата BAF60C на SWI/SNF 18 сложно ремоделиране на хроматин. индуциран от MyoD. Също така е подходящ за тестване на способността на MyoD да индуцира репресивна хроматинова среда в целевите му локуси със свързаните с него партньори и следователно да открива MyoD-зависими репресивни механизми в пролиферацията на миобласти, за да усъвършенства терминалната диференциация.

Тук ние описваме протокола за идентификация на MyoD партньори, използвайки тандемно афинитетно пречистване (TAP-Tag), съчетано с характеризиране на масова спектрометрия (MS). Използването на HeLa клетки, стабилно експресиращи S3 Flag-HA MyoD, осигурява достатъчно материал за пречистване на MyoD комплекси от фракционирани ядрени екстракти. Идентифицирането на MyoD партньори в хетероложната система беше последвано от валидиране в съответна система.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Приготвяне на екстрахиращи се със сол и свързани с хроматин ядрени фракции HeLa-S3

2. Комплекси за пречистване на протеини

Забележка: Продължете в паралелни извлечения от всяка клетъчна линия (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD и контрола, Hela-S3 Flag-HA).

3. Масспектрометричен анализ

Забележка: Следващите стъпки трябва да бъдат обсъдени с инсталацията на спектрометрия на маса, която ще извърши анализа.

  1. Добавете 3/4 (22,5 µl) проби със 7,5 µl 4x зареждащ буфер и 3,3 µl 10x редуциращ агент и кипете 5 минути при 96 ° C.
  2. Заредете пробите върху SDS-полиакриламид 4 - 12% гел. гел Работи при 150 V константа за 5 минути, за да позволи на всички протеини да влязат в гела без отделяне.
  3. Измийте гела с вода; фиксирайте за 20 - 30 минути с разтвор за фиксация (10% оцетна киселина, 50% метанол, 40% ултрачиста вода), след което измийте фиксирания гел 5 пъти в ултра чиста вода.
  4. Нарежете лентите, съдържащи протеините, съхранявайте в 1 ml вода в епруветка от 1,5 ml и я изпратете до съоръжението за масспектрометрия.

Анализ 4. Данни

Забележка: Това е общо ръководство за анализа. Точните стъпки зависят от конкретния режим на данни, предоставени от инсталацията на MSизползвани за извършване на анализа (например 21,22).

  1. Сравнете списъка с протеини, идентифицирани в "MyoD" елуатите, със списъка, получен от съответния препарат за отрицателна контрола. Изключете от анализа протеини, присъстващи в двата списъка.
  2. Премахнете протеините, които имат ≤2 общ брой пептиди, идентифицирани от останалия списък.
  3. Достъп до функционална анотация и функционална класификация на получения списък с протеини, използвайки ресурсите на DAVID Bioinformatics (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) и класифицирайте списъка с протеини 23,24.
  4. (По избор) Премахнете от списъка "стопаджии", заредени неядрени протеини със силно отрицателно заредена ДНК свързваща адвентиция 25. Те съдържат цитоскелетни, цитоплазмени, митохондриални, мембранни и рецепторни протеини (сгъване на протеини, цитоскелет и различни белтъци от група в таблици 1 и 2).
  5. Сравнете получените списъци с MyoD взаимодействащи на SE и NE фракции, за да идентифицирате специфични общи протеини и протеини за всяка фракция (Фигура 2).

5. Потвърждение на взаимодействащите лица, идентифицирани от Western Blot

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

За да разберем регулирането на MyoD активността, ние предприехме изчерпателната характеристика на MyoD комплексите, използвайки биохимично пречистване, основано на имунопречистване на двойно маркирана форма на MyoD, последвано от мас спектрометрия (MS). Използването на HeLa-S3, експресираща маркирана с флаг HA HA клетъчна линия MyoD и контролна клетъчна линия, изразяваща флаг HA, позволи да се получи достатъчно материал за пречистване на комплекса MyoD чрез извършване на пречистване с двоен афинитет на Flag-HA -MyoD.

Клетъчните екстракти се фракционират на цитоплазматични и ядрени фракции, след това допълнително се фракционират ядрената фракция на екстрахираната сол (ядрена екстрахируема сол, SE) и се обогатяват с нуклеозоми (NE нуклеозома, обогатена на фракции). Пречистване на TAP-Tag от тези отделени ядрени фракции (фигура 1, таблици 1 и 2) разрешено е да се разплитат партньори, които имат относително ниско изобилие, когато са локализирани в специфично подядрено отделение. Освен това, такава стратегия беше използвана за откриване на партньори на несвързан (SE) срещу ДНК-свързан (NE) MyoD, за да се получи представа за регулирането на MyoD активността.