G-quadruplex ДНК-афинитетен подход за пречистване на ензимно активна G4 резолваза1

Обобщение

G4 Resolvase1 се свързва с G-quadruplex (G4) структури с най-строг отчитан афинитет към G4 свързващ протеин и отчита по-голямата част от G4-DNA размотаващата активност в HeLa клетките. Ние описваме нов протокол, който се възползва от афинитета и зависимата от АТР активност на размотаване на G4-Resolvase1 за специфично пречистване на каталитично активен рекомбинантен G4R1.

Резюме

Въведение

Тук ние демонстрираме нова система за експресия и пречистване (Фигура 1) който се възползва от АТР-зависимата активност на разграждане на G4 на rG4R1 за ефективно изолиране на активния ензим. Тази система може да бъде адаптирана за пречистване на други АТР-зависими ензими на нуклеинова киселина, за които продуктът на ензимната реакция е по-скоро субстрат за свързване, какъвто е случаят с G4R1.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Подготовка на G4-ДНК структури, които да се използват за пречистване на rG4R1 (Образуване на биотинилиран G4-ДНК G-квадруплекс)

  1. Поръчайте следния ДНК олигомер, наречен Z33-Bio, в мащаб от 1 µmole: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-биотин 3'. Уверете се, че остатъкът от биотин е в 3 'края на олигомера.
  2. Пригответе 10x G4 буфер: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA и 2500 mM NaCl.
  3. Ресуспендирайте Z33 олигомера в 250 µl вода (така че концентрацията на олигомера да бъде приблизително 2.5 mM). Добавете 25 µl 10x G4 буфер и разбъркайте. Инкубирайте олигомера при 50 ° С за

48 ч. Накратко центрофугирайте епруветката за събиране на конденза (

1000 xg, 10 s). Добавяне

2. Подготовка на G4-ДНК структури за използване в ензимна активност, изследваща rG4R1 (Образуване на TAMRA, маркирана с G4-DNA)

  1. Поръчайте следния ДНК олигомер, наречен Z33-TAM, в мащаб от 1 µmole: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Уверете се, че частта TAMRA е в края на олигомер 5.
  2. Следвайте същата процедура, както е описана в раздел 1 за образуването на G-квадруплекс, с изключение на това, че ултравиолетовото (UV) засенчване не е необходимо, тъй като тетраметилродаминът (TAMRA), маркиран с G-квадруплекс, ще бъде лесно видим с окото гол. Отново, не забравяйте да включите контрол на избледняване върху гела.
  3. След като се отчете спектрофотометър на маркирана с TAMRA G-квадруплексна ДНК, както в стъпка 1, разредете образувания G-квадруплекс до 0,2 pmol/µl с TNE буфер. Накрая добавете глицерол до крайна концентрация 10% и съхранявайте при -20 ° C.

3. Трансформирайте (DE3) компетентния pLysS с PTRiEx4-DHX36 (плазмид, кодиращ човешки G4R1) и отглеждайте/индуцирайте големи бактериални култури

225 оборота в минута. Отглеждайте културите, докато OD 600 достигне около 0,4-0,6, което обикновено отнема около 4 до 6 часа, в зависимост от първоначалната плътност на клетките.
ЗАБЕЛЕЖКА: Това изисква периодично наблюдение на плътността чрез спектрофотометрични показания и е от съществено значение културите да не се отглеждат над 0,5 OD. Като заготовка за спектрофотометрични показания, центрофугирайте 1 ml бактерии и използвайте избистрения бульон като потискащ разтвор.

  • След като се получи правилната OD 600, веднага поставете културите върху лед и бързо ги охладете до 10 ° C. Следете температурата с помощта на термометър, почистен със 70% EtOH. Ускорете охлаждането чрез бързо завъртане на флаконите, докато сте на лед, което ограничава растежа на бактериите преди индуцирането на рекомбинантни протеини.
  • Добавете IPTG към крайна концентрация mM 1 (

    4. Пречистване на човешки rG4R1

    18 000 xg) в микроцентрифуга при 4 ° C (

    200 µl пречистен EB, съдържащ rG4R1. Заделете две 7 аликвотни части (в PCR епруветки, обозначени със съответната дата) за използване в анализа на ензимната активност за контрол на качеството, който ще провери дали наистина активният rG4R1 наистина е пречистен.

  • Съхранявайте пречистения rG4R1 при -80 ° C до време за анализ за активност.

    • 5. Качествен контрол на анализа на пречистената ензимна активност rG4R1

    6. Обединяване на високоактивни rG4R1 подготовки, аликвотиране и съхранение

    ЗАБЕЛЕЖКА: Тази стъпка изисква 2 души. Броят и ензимните изисквания на анализите надолу по веригата, в които ще се използва пречистеният rG4R1, ще определят колко препарати са необходими преди аликвотирането. Типичният препарат се състои от обединяване на 8 много активни препарати (като по този начин се използват общо 16 500 ml индуцирани бактериални култури), но този брой е произволен и е лабораторно специфичен.