Генетично инженерно регулиране на еукариотната генна експресия
Въвеждане на ген в клетка
Регулиране на експресията на еукариотния ген
Особености на организацията на еукариотния геном
При еукариотните организми механизмът на регулация на транскрипцията е много по-сложен. В резултат на клонирането и секвенирането на еукариотни гени са открити специфични последователности, които участват в транскрипцията и транслацията.
Еукариотната клетка се характеризира с:
1. Наличието на интрони и екзони в молекулата на ДНК.
2. Узряване на i-RNA - изрязване на интрони и зашиване на екзони.
3. Наличието на регулаторни елементи, които регулират транскрипцията, като: а) промоутъри - 3 вида, на всеки от които седи специфична полимераза. РНК полимераза I репликира рибозомни гени, РНК полимераза II - структурни протеинови гени, РНК полимераза III - гени, кодиращи малки РНК. Промоторите на РНК полимераза I и РНК полимераза II са разположени пред мястото на иницииране на транскрипция, промоторът на РНК полимераза III е в структурния ген; б) модулатори - ДНК последователности, които повишават нивото на транскрипция; в) (усилватели) усилватели - последователности, които повишават нивото на транскрипция и действат независимо от тяхното положение спрямо кодиращата част на гена и състоянието на началната точка на синтеза на РНК; д) терминатори - специфични последователности, които спират както транслацията, така и транскрипцията.
Тези последователности се различават по своята първична структура и местоположение по отношение на инициационния кодон от прокариотните и бактериалната РНК полимераза не ги „разпознава“. По този начин, за експресията на еукариотни гени в прокариотни клетки, гените трябва да бъдат под контрола на прокариотните регулаторни елементи. Това обстоятелство трябва да се вземе предвид при конструирането на вектори за изразяване.
Структурните гени, които осигуряват жизнената активност на еукариотната клетка, обикновено се транскрибират в най-активно функциониращите клетки. В същото време специфични гени, уникални за определени тъкани или органи, се транскрибират и транслират само в определени клетки. Например, гените, кодиращи субединиците α и β на хемоглобина за възрастни, се експресират изключително в клетки на предшественици на еритроцитите. Броят на различните иРНК, специфични за различните клетки, варира от няколко до десетки.
Способността на клетките да се включват (активират) или изключват (инхибират) структурните гени е изключително важна за поддържане на клетъчната специфичност и икономично използване на енергийните ресурси. Оттук и разнообразието от транскрипционни фактори с протеинова природа. Много от тях се свързват директно с нуклеотидна последователност с дължина по-малка от 10 bp, наречена по различен начин: кутия, модул, иницииращ елемент, регулаторен елемент. За разлика от прокариотите, на еукариотите най-вече липсват оперони, т.е. всеки еукариотен структурен ген има свой собствен набор от регулаторни елементи. В допълнение към медиираното взаимодействие между ДНК и протеини, протеиново-протеиновите взаимодействия също играят съществена роля в регулирането на транскрипцията при еукариотите.
Въпреки индивидуалността на набора от регулаторни елементи в структурните гени на еукариотите, всеки от тях има промоторен регион (TATA кутия или Hogness box) от осем нуклеотида, включително TATA последователността; SSAAT последователност (CAT кутия); област от повтарящи се GC динуклеотиди (GC кутия). Тези елементи са разположени на разстояние 25, 75 и 90 bp. от мястото за започване, съответно:
Регулаторни елементи на еукариотните структурни гени. Отрицателна стойност показва, че тези елементи са разположени в молекулата на ДНК вляво от мястото на иницииране на транскрипцията, обозначено с +1. Стрелка - посока на транскрипция (според Glick B., Pasternak, J., 2002)
Транскрипцията на еукариотния структурен ген започва със свързването на транскрипционен фактор към кутията TATA, която представлява комплекс от най-малко 14 протеина. След това други транскрипционни фактори се свързват с него и с ДНК областите, съседни на кутията TATA, и накрая, РНК полимераза II се свързва с целия този транскрипционен комплекс. След това, с участието на допълнителни фактори, транскрипцията се инициира в +1 точка. Ако TATA последователността отсъства или значително се променя, тогава транскрипцията на структурния ген става невъзможна.
Пример за регулиране на транскрипцията чрез взаимодействието на специфични протеинови фактори с полето TATA в тези фигури е по-долу.
Първата снимка показва слаб блясък на маркера, показващ, че синтезът продължава, но не интензивно, тъй като полето TATA не е активирано.
На втората снимка клетката свети интензивно, буквално е напълнена със специфичен протеин, чийто синтез е предизвикан от активиране на кутията TATA. Производството на протеин беше толкова високо, че плочите с клетки, дори при видима светлина, бяха в лилаво.
Транскрипционни фактори, специфични за регулаторните елементи CCAAT и GC, също са идентифицирани, но все още не е ясно как взаимодействията ДНК-протеин могат да повлияят в този случай на ефективността на транскрипцията, ако елементите са разположени на разстояние повече от 75 bp. от мястото за посвещение. В допълнение, подобрителна последователност е разположена на разстояние от стотици и дори хиляди базови двойки от мястото на иницииране, което значително увеличава скоростта на транскрипция на структурните гени. Специфичното сгъване на ДНК по време на формирането на естествената структура сближава отдалечените регулаторни елементи и съответните структурни гени. В допълнение, транскрипционните фактори, които се свързват с определени подобрители и регулаторни елементи, могат да образуват верига, свързваща сайтове, които са отдалечени един от друг.
Някои репресирани (неекспресирани) гени се активират от каскада от събития, която се задейства от някакъв специфичен извънклетъчен сигнал, например повишаване на температурата или синтез на хормони. Хормонът, навлизайки в кръвния поток, се свързва с рецепторите на специфични клетки, улеснявайки проникването му в клетката. Попадайки в клетката, хормонът взаимодейства с един от клетъчните протеини и променя своята конформация. В такова променено състояние протеинът навлиза в ядрото и се свързва със специфичен регулаторен елемент, който инициира транскрипцията на съответния ген. Има и протеини, които, взаимодействайки с регулаторните елементи, блокират транскрипцията.
Регулирането на транскрипцията при еукариотите е много сложно. Структурният ген може да има много регулаторни елементи, които се активират от специфични сигнали в различни видове клетки в различно време от клетъчния цикъл. В същото време някои структурни гени са под контрола на уникален транскрипционен фактор. Специфични протеини могат да взаимодействат с определени регулаторни елементи и да блокират транскрипцията или да се свързват с целия транскрипционен комплекс дори преди започване на транскрипция или по време на удължаване