Генериране на мутанти на делеция на генни делеции в Pseudomonas aeruginosa и тестване за вирулентност

Обобщение

Тук описваме прост и възпроизводим протокол на миши модел на инфекция, за да оценим затихването на генетично модифицираните щамове на Pseudomonas aeruginosa в сравнение с одобрената от САЩ администрация по храните и лекарствата (FDA) Escherichia coli за търговска употреба.

Резюме

Въведение

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Преди започване на експерименти с животни протоколът, който ще се използва, трябва да бъде одобрен от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните (IACUC). Одобрение за описания протокол е получено от IACUC в Университета Маршал (Хънтингтън, WV, САЩ).

  1. За да създадете генетична делеция, използвайки плазмида pEX100T-NotI, клонирайте регионите на ДНК, фланкиращи желаната делеционна последователност, и ги вкарайте в NotI рестрикционното място на плазмида. Плазмидната вложка трябва да съдържа около 500 нуклеотида преди целевата последователност, които са в непосредствена близост до около 500 нуклеотида след целевата последователност за изтриване. Освен това вложката трябва да съдържа последователността за разпознаване на NotI (GCGGCCGC) в нейните 5 'и 3' краища (Фигура 1Б.).

  1. Вариант 1: използвайте традиционни техники на клониране. Използвайте PCR за амплифициране на геномни области преди и след гена, който ви интересува, последвано от кръстосана PCR 9, 10, за да се присъедини към генерираните фрагменти, рестрикционно ендонуклеазно смилане на PCR продукта и плазмида и лигиране 11 (Фигура 1B, C).
  2. Вариант 2: След проектиране на последователността на изтриване в силико, толерирайте компания, която синтезира de novo, да я вмъкне в плазмида pEX100T-NotI. Много компании рационализираха процеса на клониране, за да генерират бързо и ефективно плазмида, който представлява интерес. Освен това последователностите проверяват дали плазмидите не съдържат мутации преди доставката.

  1. Трансформирайте електрокомпетентната Е. coli с плазмида съгласно препоръките на производителя. С помощта на стерилна инокулационна верига, нанесете 10 l от реакцията на трансформация за изолирани колонии върху предварително затоплена плоча от агар от Luria Broth (LB), допълнена със 100 g/ml карбеницилин и инкубирайте една нощ при 37 ° C.
    ЗАБЕЛЕЖКА: С цялото оборудване и носители, използвани за култивиране на бактерии, трябва да се борави в съответствие с институционалните указания за безопасност.
  2. Минете два пъти.
    1. Извадете плочата от инкубатора и идентифицирайте изолирана колония. Използвайки стерилна инокулационна верига, вземете колонията и отстранете предварително затоплена LB агарна плоча, допълнена със 100 g/ml карбеницилин за изолирани колонии. Инкубирайте една нощ при 37 ° C. Повторете тази стъпка отново, за да генерирате чиста култура.
  3. С помощта на стерилна инокулационна примка, инокулирайте 5 ml LB с една колония от последната плоча с агар. Поставете културата в разклащащ се инкубатор при 37 ° С за една нощ. На следващия ден смесете 1 ml от тази култура с 1 ml 5% в криофиал и съхранявайте при -80 ° C, за да създадете замразени запаси от сорта.

4. Препарат за разпръскване на бактерии и трипарентална конюгация

5. Откриване на единични кръстосани рекомбинанти на P. aeruginosa

6. Откриване на двойна P. aeruginosa над рекомбинанти

  1. За всяка бульонна култура инокулирайте 10 L култура върху предварително загрята PIA плоча, допълнена с 10% захароза (без глицерин) и ленти за изолирани колонии. Инкубирайте плаките една нощ при 37 ° С.
  2. На следващия ден извадете чиниите от инкубатора и ги изследвайте за растеж. Захарозоустойчивите колонии трябва да бъдат двойни кръстосани рекомбинанти (т.е. да са отстранили плазмида от хромозомата чрез рекомбинационно събитие между другата хомоложна област на плазмидната вложка и хромозомата на P. aeruginosa).
    1. Отворете най-малко 20 колонии със стерилни клечки за зъби върху предварително загряти плочи от: 1) PIA, 2) PIA, допълнена с 10% захароза (без глицерин) и 3) PIA, допълнена с 300 g/ml карбеницилин.
  3. Инкубирайте плаките една нощ при 37 ° С.
  4. Извадете плочите от инкубатора и ги изследвайте за растеж. Истинските двойни кръстосани рекомбинанти ще бъдат чувствителни към карбеницилин и устойчиви на захароза (т.е. колонии, които са се разраснали на PIA и PIA, допълнени със захароза, но не са нараснали на PIA, допълнени с карбеницилин).

7. Потвърждение за изтриване на гени чрез колония PCR

8. Подгответе бактериален щам за тестване върху животни

VE2 и PGN5:
aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
aroA R: ATCTGGCTCGATGCCGGTCC

  • Инкубирайте културите в разклащащ се инкубатор при 160 rpm и 37 ° C, докато достигнат растеж на логаритна фаза (т.е. OD600 измерване 0,4-0,6 на спектрофотометър).
  • Използвайки OD600, получен от Log Phase постигнато, изчислете обема на бульона, необходим за получаване на 2,5 х 10 9 единици за изображение на колония (CFU) на ml. Пелетирайте обема на бульона в епруветки от 50 ml при 4500 х g за 10 минути.
  • Изхвърлете супернатантата и заменете гранулата в епруветка с 50 ml 1x PBS, за да измиете клетките. Отново центрофугирайте при 4500 х g за 10 минути.
  • Изхвърлете супернатантата и суспендирайте отново гранулата в 25 ml 5% обезмаслено мляко в 1x PBS.
    1. Стъпка на валидиране: Използвайте проба от 25 ml ресуспендиране, за да извършите жизнеспособно броене на плаки, за да определите броя на CFU/ml.
  • Аликвотирайте 25 ml ресуспендиране на обезмаслено мляко в 2 ml култури в 2 ml криовиали. Замразявайте флаш в течен азот и съхранявайте при -80 ° C поне една нощ преди употреба.

    • 9. Проверка на запасите от растеж и щам, които ще бъдат запазени за тестване върху животни.

    1. За всеки сорт, който ще бъде тестван, отстранете най-малко 3 криовиалчета от замразени запаси от -80 ° C съхранение и размразете при 4 ° C за 2-4 часа. Ако остане замразено количество, затоплете за кратко при 37 ° C.
    2. Вземете малки проби от всеки криовиал, за да потвърдите всеки сорт.
      1. Извършете броя на жизнеспособните плаки, за да определите броя на CFU/mL. Нормално е да има по-малко CFU/ml след замразяване поради смъртта на някои бактериални клетки.
      2. Използвайте PCR и специфични за разтягане грундове, за да валидирате всеки щам.
      3. Плъзнете всеки печат върху селективен носител, за да проверите фенотипа.
    3. След като потвърдите, че щамовете са с правилния генотип и фенотип и валидират CFU/ml, преминете към тестване върху животни.

    10. Ваксиниране на животни с бактериални щамове чрез инжектиране

    11. Статистически анализ на смъртността при животните

    12. Визуализирайте инфекцията с биолуминесценция

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    Както на фигура 2Както е показано, целевата геномна делеция може да бъде потвърдена с PCR на колония със специфични праймери, които подсилват региона на интерес. Колониите, които носят геномна делеция, водят до по-малък размер на PCR лентата в сравнение с колонии от див тип. PCR екран от 10-12 колонии обикновено е достатъчен, за да се открие поне една колония, носеща целевата делеция. Ако изтривания не бъдат открити след няколко кръга на екрана, повторете процеса, който започва с конюгиране. Ако заличаването все още не успее, може да се наложи разгръщането на плазмида да бъде потвърдено чрез секвениране, редизайн или фатална последователност. След като проверите делецията на ген чрез PCR, потвърдете делецията чрез секвениране. Полученият щам може да бъде подложен на процеса многократно, за да се получат последователни геномни модификации.

    Както на фигура 3Както е показано, смъртността, свързана с интраперитонеално инжектиране на атенюирания щам на P. aeruginosa PGN5 (+ mucE), е 0%, което е същото като наблюдаваното при E. coli BL21. От друга страна, интраперитонеалното инжектиране на родителския щам (VE2) е фатално за 80% от мишките. Тези резултати бяха постигнати с обширни стъпки за валидиране на инжектираните щамове. Докато точната причина за смъртта при тези мишки е неизвестна, тя може да бъде проследена, поне отчасти, до експресията на фактори на вирулентност в родителския щам, които са били изтрити от атенюирания щам PGN5. Разликите в прогресията на инфекцията са проследени с родители, маркирани с биолуминесценция и атенюирани щамове. Атенюираният ствол остава локализиран на мястото на инжектиране, докато биолуминесценцията избледнее (Фигура 4). Изчистването на инфекцията най-вероятно съвпадна с избледняването на биолуминесценцията. Биолуминесценция не е открита 24 часа след инжектирането и мишките са живели седмици след инжектирането, докато не бъдат убити, без да се наблюдават странични ефекти.

    генни
    Фигура 2: Гел електрофореза на PCR продукти от колония от aroA делеционен екран за генериране на атенюиран щам P. aeruginosa, PGN5. Продуктите на PCR за колонии, работещи в ленти 2-5 и 8-11, показват колонии с aroA от див тип. Продуктите на Colony PCR, работещи в ленти 6 и 7, носят ерата на делецията на гена, което се обозначава с по-малкия PCR продукт (жълта звездичка). Използваните праймери специално подобряват геномната област, съдържаща aroA гена: aroA-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGCUND и aroA-R: ATCTGGCTCGCTCTGCCGGTCC. Очакваният размер на PCR продукта в дивите колонии е 2548 нуклеотида (nt). Очакваният размер на PCR продукта в колонии с делеция на aroA е 307 nt. ДНК стълба беше насочена в платна 1 и 12. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

    делеция
    Фигура 3: Обща смъртност на мишки, заразени с патогенен щам P. aeruginosa (VE2), атенюиран щам P. aeruginosa (PGN5 + mucE) и FDA контрол E. coli щам (BL21). Само мишки, инжектирани с патогенния родителски щам, са имали смъртност от 80%. Атенюиран щам на P. aeruginosa и FDA контрол E. coli има смъртност от 0%. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

    генни
    Фигура 4: Изображение на мишката 3 часа след инжектирането на атенюиран щам на P. aeruginosa PGN5 + mucE с биолуминесцентен маркер. Биолуминесцентните бактерии се откриват до 18-24 часа след инжектирането. През това време биолуминесценцията остава на мястото на инжектиране, което предполага, че бактериите са останали локализирани на мястото на инжектиране. Тази мишка се възстанови напълно без неблагоприятни ефекти. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Плазмидът pEX100T-Not1 е ефективен медиатор на последователни геномни делеции, които не съдържат маркери и са в рамка. Когато се развиват щамове бактерии за атенюирана вирулентност, изтриването на цели генни последователности вместо генерирането на точкови мутации намалява вероятността от връщане към вирулентен фенотип. В допълнение, всяко заличаване на гена за патогенност допълнително намалява патогена и повишава стабилността на демпфирането.

    Този метод може също да се използва за създаване на геномни модификации, различни от делеции, като точкови мутации и вмъквания, просто чрез промяна на дизайна на плазмидната вложка. Този тип модификации могат да бъдат по-полезни от цели генни делеции за технически бактерии с модифициран метаболизъм, например. Последователната геномна модификация има значителен потенциал за генериране на дизайнерски бактериални щамове за специфични цели в научните изследвания и индустрията. Други методи за генериране на желани без маркери геномни модификации в бактериите са описани 15, 16, 17, 18. Както при всички методи за редактиране на геном, опитите за модификация на основни области на генома могат да бъдат фатални и следователно неуспешни. В тези случаи се изисква идентифициране на различни генетични модификации или други кандидат-гени, за да се генерира бактериалният щам, който представлява интерес.

    Предвид многобройните репликационни събития и пасажи на всяка колония в този протокол, ще настъпят неволни промени в генома на произведения сорт. Точните геномни промени могат да бъдат идентифицирани чрез секвениране на целия геном. Ефектите от тези промени обаче са по-трудни за определяне. Когато се развиват бактерии с определена цел, геномните промени, които не влияят отрицателно върху растежа на организма или целевите пътища, са допустими. В зависимост от генерирания щам може да е възможно да се идентифицира „отчитане“, за да се гарантира, че сортът продължава да бъде полезен по предназначение. Например с PGN5 целта беше да се създаде атенюиран щам, който да запази способността да произвежда големи количества алгинат. След изтриване на пет гена за патогенност, количеството и съставът на алгината, произведен от PGN5, се измерва и се установява, че са сравними с други щамове, произвеждащи алгинат. Производството на алгинат не е повлияно от петте генни делеции или от неволните геномни промени, настъпили по време на развитието на PGN5.

    Използването на биолуминесценция като маркер позволява допълнително валидиране на инжектираните бактериални щамове, тъй като маркерът може да се визуализира на мястото на инжектиране. Вмъкването на биолуминесцентния маркер в бактериалната хромозома е необходимо за биолуминесцентно изобразяване, но може да не е възможно при работа с несъвместими щамове/видове. Въпреки това, не е необходимо маркиране на щамове с биолуминесценция, за да се тества за отслабване. Щамовете, тествани в това проучване, са белязани с биолуминесценция, което позволява визуализиране на разликите в локализацията между щамовете по време на инфекцията. Наблюдавахме, че патогенният щам се разпространява през тялото на мишката, но непатогенният щам остава на мястото на инжектиране. Докато този експеримент е тествал само два много тясно свързани щама на P. aeruginosage, той предполага, че разпространението на бактерии е свързано с вирулентност, поне при P. aeruginosa. Този метод на маркиране с биолуминесценция може да се използва за визуализиране на прогресията на инфекцията в бъдеще, за да се оцени бързо затихването на техническите бактериални щамове.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Разкриване

    Авторът, Hongwei D. Yu е главен научен директор и съосновател на Progenesis Technologies, LLC.