Генериране на химерни мишки с мутации в сигналния домейн на CD22 и
Генериране на химерни мишки с мутации в областта на проводимост на сигнала на CD22 и изследвания на функцията на CD22 при нокаутиращи мишки Дисертация за получаване на научна докторска степен от Баварския университет на Юлий Максимилианс във Вюрцбург, представена от Клаус-Петер Данцер от Манхайм-Некарау Вюрцбург, 2002
Представено на: Членове на докторската комисия: Председател: Рецензент: Д-р обратно нат. хабил. Ларс Ницке Рецензент: проф. Д-р обратно нат. Герт Пфлугфелдер Ден на докторския колоквиум: Докторско свидетелство, раздадено на:
Обяснение: С настоящото заявявам, че съм написал дисертацията „Генериране на химерни мишки с мутации в сигналния домейн на CD22“ и разследвания за функцията на CD22 при нокаутиращи мишки и че не съм използвал никакви инструменти или източници, различни от посочените от мен. Също така заявявам, че тази дисертация не е представена в друга процедура на изпит, нито в същата, нито в различна форма. Освен степените, документирани в заявлението за прием, преди това не съм придобивал или се опитвал да придобия допълнителни академични степени. Вюрцбург, Клаус-Петер Данцер
Тази работа е извършена между 15 януари 1998 г. и 31 януари 2002 г. в Института по вирусология и имунобиология на Баварския университет Юлиус Максимилианс във Вюрцбург под ръководството на д-р. обратно нат. хабил. Ларс Ничке направи.
IV 7.2 Списък на публикациите. 111 7.2.1 Оригинални тези от тази докторска дисертация. 111 7.2.2 Публикации на конгреси/конференции. 111 8. Приложение. 113 8.1 Съкращения. 113 8.2 Грундови последователности. 115 8.3 Векторни карти. 117 9. CV. 120
13 отделение. Следователно имаше основание да се подозира, че броят на MZ В клетките в CD22 -/- мишки може да бъде намален. Следователно трябва да се проучи размерът на MZ B-клетъчното отделение при CD22 -/- мишки и последиците от евентуално намаляване на отговора към TI-2 антигени.: α2,6-сиалова киселина CD22-ITIM-KO CD22-Безречен Syk SOS? Grb-2 P Y- P Y- P Y- -F ITIM SHC Grb-2 SHIP Lyn PI3K PLCγ2 -F ITIM -F ITIM SH2 SH2 PTPase SHP-1 Фиг. 3: Два планирани модела на мишка за изследване на сигналната трансдукция на CD22 in vivo . Лява страница: CD22-ITIM-KO: Тирозините в ITIM са мутирали до фенилаланини. Очаква се, че инхибиращият сигнала протеин тирозин фосфатаза SHP-1 вече не може да взаимодейства с CD22 и по този начин може да бъде активиран. За разлика от това, свързването на положителните модулатори на сигнали на B-клетки PLCγ, Lyn, PI3K и Grb-2 все още ще бъде възможно. Също така е възможно да се обвърже SHIP като част от комплекс SHIP-Grb2-Shc. Дясна страна: CD22-без опашка: Стоп кодон в екзон 12 води до експресията на CD22 молекула без цитоплазмен домен. Този модел мишка ще допълни CD22-ITIM-KO. И двата модела ще служат за изясняване на връзката между предаването на сигнала и адхезионната функция на CD22.
14 2.1 Материали 2. Материали и методи 2.1.1 Бактериални щамове E.coliNM522: (F`lacIq (lacz) m15 proa + prob + (hsdms-mrcb) 5 (lac-proab) supe thi-1 lambda) първоначално е служил като клониращ щам Е. .coliDH5α: F- delta (laczya-argf) u169 phi80delta (lacz) m15 enda1 reca1 hsdr17 deor thi-1 supe44 gyra96 rela1 rpsl lambda- беше използван като стандартен щам за клониране в по-късния ход на тази докторска дисертация E. coliBNN1321 enda sup96: sua196 supe196: sua1: sua1 delta (lac-proab) (F trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15) lambdakc (kan-cre) беше използван за тестване на функционалността на loxp последователностите в използваните конструкции за насочване. E. coliJM110: F [trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15] dam dcm supe44 hsdr17 thi leu thr rpsl lacy galk ara tona tsx delta (lac-proab) lambda служи като щам гостоприемник за плазмиди, които режат с метилаза чувствителен рестрикционен ендон би трябвало. 2.1.2 Химикали Освен ако не е посочено друго, лабораторните химикали са от Roth (Karlsruhe) или Merck (Darmstadt) 2.1.3 Многократно използвани буфери и разтвори TE буфер 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, pH 8.0 PBS (фосфатно буфериран Физиологичен разтвор) 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4, 0,133 g CaCl 2 2H 2 O, 0,1 g MgCl 2 6H 2 O с HCl ph7.2 FACS буфер 1 x PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN 3
36 loxp loxp pcd22-itim-ko tk neo 1112 13 14 15 насочен геном. Locus loxp loxp tk neo рекомбинирано Locus Cre изтриване loxp rec./ cre-delet. Локус екзон 11-15 мутирали ITIM (Y F) 1 kb Фиг. 6: Ход на хомоложната рекомбинация на вектора pcd22-itim-ko с ендогенния CD22 локус. Последващото изтриване на селекционната касета с Cre рекомбиназа оставя само мутиралите ITIM в екзони 13 и 15 и loxp последователност в интрон 14/15 като промени.
43 neo probe pcd22-3bs-hindiii probe EBEBE 1112 13 14 15 9.5 kb WT EcoRI фрагмент gen. Locus EB 11 kb WT BamHI фрагмент B насочен към EBE tk neo B loxp loxp EB рекомбиниран локус EE 9.5 kb рекомбиниран 3 kb рекомбиниран EB 9 kb рекомбиниран B 6 kb рекомбиниран B exon 11-15 мутация (стоп кодон) Фиг. 11: CD22 локус от див тип и локус, рекомбиниран с pcd22-ex12-stop с места на разцепване за рестрикционните ензими BamHI (B) и EcoRI (E. ). Показаните фрагменти възникват след разграждане с EcoRI или BamHI. Промени в рестрикционните фрагменти от див тип (WT) възникват в случай на рекомбинация чрез EcoRI интерфейси в неокасетата или чрез BamHI интерфейса в праймерите за мутагенеза.
44 a) 11kb wt/wt wt/без опашка M12.2.3 M12.4.1 b) 9.5kb wt/wt wt/без опашка M12.2.3 M12.4.1 9.5kb 9kb 6kb 3kb храносмилане: BamHI сонда: pcd22-3bs-hiii смилане: EcoRI сонда: pcd22-3bs-hiii в) wt/без опашка wt/wt M12.2.3 M12.4.1 9kb смилане: BamHI сонда: neo Фиг. 12: Южни петна на правилно рекомбинираните CD22-Tailless ES клетъчни клонинги M12 .2.3 и M12.4.1, всеки показан с контролен клонинг от див тип (тегло/тегло). Схематично представяне на локуса от див тип и рекомбинирания локус, фрагментите, които са резултат от храносмилането с EcoRI или bamhi, и сондите, вж. Фигура 11. а) CD22-ITIM-KO Геномна ДНК на CD22-ITIM-KO клонингите, идентифицирани като положителни, се усвоява с BamHI. BamHI разграждането на локуса от див тип води до рестрикционен фрагмент от 11 kb. Интегрирането на конструкцията pcd22-itim-ko в локуса от див тип увеличава това
45 фрагмент на 14 kb. Pcd22-3bs HindIII и сондата в неокасетата отново бяха използвани като сонда. Фигура 13. pcd22-3bs-hindiii-sonde neo-sonde BBB 1112 13 14 15 11 kb WT BamHI фрагмент B ген. Локус насочване на рекомбиниран локус B loxp tk дава преглед на фрагментите, образувани в BamHI разграждането и използваната сонда neo loxp BB 14 kb рекомб. BamHI фрагмент B exon 11-15 мутирал ITIM (Y F) 1 kb Фиг. 13: CD22 локус от див тип и локус, рекомбиниран с pcd22-itim-ko с места на разцепване за рестрикционния ензим BamHI (B). Показаните фрагменти възникват след разграждане с BamHI. Чрез интегриране на нео/tk касетата, рекомбинираният локус се увеличава с 3 kb в сравнение с дивия тип локус. Като пример, ФИГУРА 14 показва Southern blot на CD22-ITIM-KO клонингите YFtar3F1 и YFtar10E3. Петната показаха, че YFtar3F1 и YFtar4E6 не съдържат допълнителни интеграции. За YFtar10E3 обаче в генома е намерено друго копие на конструкцията (не е показано).
57 pcd22-itim-ko loxp loxp 1 kb tk neo 1112 13 14 15 1) Намиране на геномна последователност 2) Разработване на стратегия за клониране 3) PCR клониране 4) Последователност 5) Изтриване на HSV-tk loxp loxp neo 8 9 10 1112 13 14 15 129/ola pcd22-itim-ko-ext-tk exon 8-15 мутирали ITIM (YF) Фиг. 17: Да се увеличи честотата на хомоложна рекомбинация на вектор C57BL/6 pcd22-ITIM-KO в неизогенни 129-ES клетъчни линии, векторът се удължава с PCR-амплифицирана част от E14Tg2a DNA. Предпоставка беше намирането на почти пълна последователност от мишка CD22 при търсене в база данни. С междинния етап на двата вектора pcd22-itim-ko-ext (не е показан), показан на снимката, беше извършен експеримент за насочване в ES клетъчната линия WW6 (виж текста).
58 Конструиране без опашка (03/99) ITIM-KO (11/99) Без опашка (05/00) ITIM-KO (05/00) ITIM KO (06/00) ES клетъчна линия Брой на клонирани скринирани PCR положителни PCR възпроизвеждане. C57BL/6-III 300 8-4 C57BL/6-III 500 5 3 3 C57BL/6-III 200 3 2 2 C57BL/6-III 150 2 2 2 Southern Blot C57BL/6-III 400 0 - - - променени условия на култура: Нова среда, PBS, Pen/Strep, Gln, β-me ITIM-KO (08/00) циферблат според PCR-Optim. Без опашка (08/00) циферблат според PCR-Optim. ITIM-KO (11/00) Без опашка (11/00) ITIM-KO (02/01) Без опашка (07/01) BALB/cI 600 0 - - - 150 1 0 - - BALB/cI 600 1 0 - - 600 7 0 - - C57BL/6-III 500 6 2 - C57BL/6-III 400 12 11 - E14Tg2a 500 2 0 - - E14Tg2a 650 2 0 - - Des. M12 2.1, 2.3, 4.1, 4.2 YFtar3F1, 4E6, 10E3 M12 8D1, 10D5 YFtar12B5, 12A4 YFtar29D2, 30F1 M12 15F5, 17B3,17B7, 17C7,18A3, 18B5,19A1, 19F2,21C4, 21E5d2c2 -itim-ko pcd22-itim-ko-ext-tk, използвайте ESGRO ITIM-KO (10/01) WW6 400 0 - - - ITIM-KO E14Tg2a 960 0 - - - Раздел 1: Преглед на всички експерименти с насочване на гени от тази докторска дисертация и получените хомоложно рекомбинирани клонинги
59 месеца/година инжектор за клониране на проход младо чифтосване 05/00 M12 2,3 M12 4,1 приблизително P 30 приблизително P 30 06/00 YFtar3F1 приблизително P 21 09/00 M12 10D5 приблизително P 17 09/00 YFtar12B5 приблизително P 17 YFtar3F1Cre C/B2 приблизително P 32 B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann none - none - none - 2 химера B. Kneitz none - с BL/6, без зародишна линия 12/00 12/00 01/01 03/01 03/01 04/01 05/01 07/01 08/01 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2, C/B4 YFtar3F1Cre B1 YFtar12B5 Cre S2F4, S2B5 YFtar S2C12 S1C8 YFtar12B5 Cre S1F7, S2F7 YFtar12B5 Cre S1A1, S3A7, S3D8 YFtar12B5 CreS3B8 приблизително P 32 B. Kneitz 8 момчета, 4 от тях химерни приблизително P 32 B. няма - приблизително P 32 Ledermann няма - приблизително P 34 B. Kneitz 2 мъртви, 6 мъртви - приблизително P 32 приблизително P 26 приблизително P 26 B. Kneitz B. Kneitz B. Ledermann 5 момчета, 1 от тях химерно 7, 1 високо химерно (умряло) няма - приблизително P 27 B Kneitz няма - приблизително P 27 B Kneitz няма - приблизително P 28 B. Kneitz none - с BL/6, без зародишна линия с BL/6, без зародишна линия n - Таблица 2: Преглед на всички инжекции с бластоцисти на хомоложно рекомбинирани и напълно характеризирани ES клетъчни клонинги, извършени по време на тази докторска дисертация
63 вектор pcd22-itim-ko по отношение на прекъснатата връзка SHP-1 много вероятно. 149 39 35 CD22-ITIM-KO 4A1 147 53 48 CD22-ITIM-KO 6D4 140 48 35 CD22-wt Ib.D4 148 37 41 CD22-wt Vb.C3 4 6 Контролен IgM CD22 a2,6-sia Фиг. 18: Повърхностна експресия на CD22 и a2,6-сиалова киселина върху клонове J558L-CD22-wt и J558L-CD22-ITIM-KO, избрани за изследване на фосфорилирането на тирозин и асоциирането на SHP-1 на CD22. Изразът на повърхностните маркери е показан като хистограма, MFI е даден за всяка хистограма.
68 WT CD22 -/- 55,5 89,5 10,5 6,5 95,5 58,7 4,5 2,8 43 67 20,9 33 59,5 92,1 7,9 5,1 B220 + Sialidase NeuGc-SA 63,5