Експериментален подход за изследване на сигнализирането за лептин в каротидните тела и неговите ефекти върху контрола
Обобщение
Нашето проучване се фокусира върху ефектите на сигнала за лептин в каротидното тяло (CB) върху хипоксичния вентилационен отговор (HVR). Проведохме експерименти за "загуба на функция", за да измерим ефекта на лептина върху HVR след денервация на CB и експерименти за "усилване на функцията", за да измерим HVR след свръхекспресия на лептиновия рецептор в CB.
Резюме
Хормонът, произведен с адипоцити, лептин, е мощен стимулатор на дишането, който може да играе важна роля в защитата на дихателната функция при затлъстяване. Каротидните тела (CB), ключов орган на периферната хипоксична чувствителност, изразяват дългата функционална изоформа на лептиновия рецептор (LepR b), но ролята на лептиновата сигнализация в контрола на дишането не е напълно изяснена. Изследвахме хипоксичния вентилационен отговор (HVR) (1) при мишки C57BL/6J преди и след инфузия на изходен лептин и след денервация на CB; (2) при мишки с дефицит на LepR b, затлъстели db/db мишки в началото и след свръхекспресия на LepR b в CB. При мишки C57BL/6J повишената с лептин HVR и ефектът на лептина върху HVR бяха премахнати чрез CB денервация. При db/db мишки, експресията на lepR b в CB удължава HVR. Следователно заключаваме, че лептинът в CB работи за подобряване на реакциите на хипоксия.
Въведение
Адипоцитът произвежда хормона лептин, който действа в хипоталамуса, за да потисне приема на храна и да увеличи метаболизма. Изследвания в нашата лаборатория 1, 2 и от други изследователи 3, 4 показват, че лептинът повишава хиперкапничната дихателна реакция (HVR), хиповентилацията на затлъстяването в лептина предотвратява дефицит на затлъстяване. Въпреки това, по-голямата част от затлъстелите индивиди имат високи нива на плазмен лептин и показват резистентност към метаболитните и респираторни ефекти на хормони 5, 6, 7, 8. Резистентността към лептин е многофакторна, но ограничената пропускливост на кръвно-мозъчната бариера (BBB) към лептин играе важна роля. Ние предлагаме, че под BBB, лептинът действа в ключов орган с периферна хипоксична чувствителност, каротидно тяло (CB), за да защити дишането при затлъстели индивиди. CBs изразяват дългата функционална изоформа на лептиновия рецептор, LepR b, но ролята на CB в по-дишащите ефекти на лептина не е изяснена адекватно 9, 10 .
Целта на нашия метод беше да изследва ефекта на сигнализирането за лептин в CB върху HVR. Нашата обосновка беше (а) да извършваме спекулационни изключения от функционални експерименти при мишки с непокътнати каротидни тела и денервирани каротидни тела, последвани от измервания на HVR; б) Укрепване на функционални експерименти върху db/db мишки без LepR b, при които измервахме HVR в началото и след експресията на LepR b изключително в CB. Ползата от нашите техники беше, че проведохме всички наши експерименти върху необуздани, неестетизирани мишки по време на сън и будност. Предишни изследователи са провеждали експериментите си под анестезия 9 или не са измервали ефектите на лептина по време на сън 10. В допълнение, нашето проучване е първото, което използва уникален подход за печалба на функция със селективен LepR-b израз в CB, описан по-горе.
В широк контекст нашият подход може да бъде обобщен за други рецептори, изразени в CB и тяхната роля в хипоксичната чувствителност. Изследователите могат да инжектират лиганд към рецептор от интерес и да измерват HVR в началото и след CB денервация. Като допълващ подход, рецептор от интерес може да бъде свръхекспресиран при измервания на CB и измерванията на HVR могат да се извършват преди и след свръхекспресията с нашата технология, описана в този ръкопис.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Всички експериментални протоколи са одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните (MO18M211).
ЗАБЕЛЕЖКА: За да проучим ефекта на лептина върху дишането, ние вливахме лептин подкожно в слаби мишки C57BL/6J чрез осмотична помпа, за да повишим нивата на циркулиращ лептин до тези, наблюдавани при мишки с наднормено тегло.
- Подготовка на осмотична помпа
- Претеглете празната помпа, за да проверите нетното тегло на заредения разтвор.
- Добавете лептин (5 mg/ml) към осмотичната помпа (1 L/h за 3 дни). Напълнете помпата с малка спринцовка (1 ml). След пълнене затворете помпата с включената в задната част наклонена 27-пистова тръба за пълнене.
ЗАБЕЛЕЖКА: Спринцовката и прикрепената тръба трябва да са без въздушни мехурчета. - След пълнене претеглете помпата отново, за да проверите нетното тегло на разтвора.
- Поставете лептиновата помпа подкожно в междулопаточната област.
ЗАБЕЛЕЖКА: Ако искате незабавно да започнете инфузията, инкубирайте предварително напълнената помпа при 37 ° C при 37 ° C за поне 4 до 6 часа (за предпочитане през нощта).
2. Хипоксична вентилационна реакция (HVR)
3. Денервация на каротидно тяло или дисекция на каротиден синусов нерв (CSND)
ЗАБЕЛЕЖКА: Извършихме комбинирана хирургична и химическа денервация с интервал от една седмица, тъй като хирургичната денервация сама по себе си не премахва хипоксичния хеморефлекс.
4. Експресия на LepR b в CB с аденовирусен вектор (Ad-LepR b) срещу контрол (Ad-LacZ)
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Непрекъснатото вливане на лептин значително повишава HVR при слаби мишки C57BL/6J от 0,23 на 0,31 ml/min/g/FiO2 (P Фигура 2) 11. CSND премахна индуцираното от лептин повишаване на HVR (Фигура 2), докато не са наблюдавани смекчаващи ефекти на CSND върху HVR в групата с фалшива хирургия след вливане на лептин.
Експресията на LepR b в CB на мишки със затлъстяване db/db с дефицит на LepR b индуцира значително увеличение на HVR от 0,05 до 0,06 ml/min/g/SpO2 (Фигура 3). HVR не се променя при животни, трансфектирани в CB с контрола Ad-LacZ.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
Фокусът на нашето проучване беше върху изследването на по-дишащите ефекти на лептиновата сигнализация в CB. Разработени са няколко протокола за оценка на ролята на лептина по механистичен начин. Първо, специфичният принос на CB към IHL беше анализиран чрез внимателно количествено определяне на IHL през първите 2 минути на хипоксична експозиция. Второ, значението на CB за медиираното от лептин регулиране на дихателния контрол беше изследвано чрез два допълващи се подхода. При постни мишки от див тип с ниски нива на лептин, HVR е измерен в началото и след продължителна инфузия на лептин; експериментът се повтаря след денервация на CB. При мишки с дефицит на LepR b/db, HVR е измерен в CB в началото и след експресията на LepR b.
CSND при мишки е технически взискателен поради малкия размер на животните и техните CB. Ние разработихме последователно успешен подход със степен на оцеляване от почти 100% при стриктно спазване на нашия протокол. Контролираните условия в нашия протокол включват термо неутрална среда, внимателно контролирана анестезия и стандартни стерилни микрохирургични техники с визуализация на глософарингеалния нерв като бдително следоперативно лечение с контрол на болката. Нашият опит показва, че хирургичната денервация сама по себе си не премахва хипоксичния хеморефлекс. Втората стъпка, химическата денервация, е последвана от внимателно следоперативно управление за подобряване на преживяемостта.
Нашата най-иновативна техника е селективна генна свръхекспресия в зоната на CB. Този подход все още не е приложен, тъй като CB са само с малки размери и не са изразени конкретни драйвери, които дават възможност да се изрази ген от интерес за определен тип клетка. Всъщност, тип I CB клетки са много подобни на симпатиковите неврони или клетки на надбъбречната медула, докато клетките от тип II са подобни на астроцитите 20, 21. Възползвахме се от db/db мишки, които нямат гена LepR b, способността ни да прилагаме аденовирусна суспензия почти изключително върху зоната на CB и свойствата на Matrigel матрицата, която се втвърдява бързо при 37 ° C. Нашият нов подход може да се използва в бъдеще за изследване на ролята на всеки ген, който експресира специфични за тирозин хидроксилаза (клетки тип I) или специфични за GFAP (клетки тип II) нокаути в CB с мишки с цялото тяло става.
Нашите протоколи имат няколко ограничения. Първо използвахме 3% CO2 за определяне на IHL и остава въпросът дали делът на IHL всъщност може да се отдаде на хиперкапничния отговор. За да се справят с това ограничение, изследователите могат едновременно да измерват реакциите на компенсация на 3% CO2 в хипероксичен газ, което би изключило CB. Второ, HVR не може да бъде напълно елиминиран от CSND 22. Това явление може да се отдаде на невропластичност, която е особено изразена при мишки. Следователно е важно да се изследва HVR възможно най-скоро след CSND и винаги да се използва фалшив хирургичен контрол. Трето, в нашия подход за експресия на CB гени липсва клетъчен тип и органна специфичност. Молекулярните техники с бъдещото използване на по-селективни промотори могат да помогнат да се противодейства на това ограничение.
В заключение, въпреки описаните по-горе ограничения, нашите протоколи могат да изследват ролята на някои CB гени във физиологичния отговор на хипоксия.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Разкриване
Авторите нямат противоречиви интереси или разкрития.