Двуизмерен протокол за електрофореза в гел (преведен на немски)
Общ преглед
Двуизмерната гел електрофореза (2DGE) е техника, която може да отдели хиляди биомолекули от смес. Тази техника включва два различни метода на разделяне, свързани заедно: изоелектрично фокусиране (IEF) и електрофореза в натриев додецил сулфат полиакриламиден гел (SDS-PAGE). Това физически разделя съединенията по две оси на гела чрез техните изоелектрични точки (електрохимично свойство) и техните молекулни тегла.
Процедурата в това видео обхваща ключовите понятия на 2DGE и обща процедура за характеризиране на състава на сложен протеинов разтвор. Три примера за тази техника са показани под заглавието на приложенията, включително откриване на биомаркер за иницииране и прогресиране на заболяването, контролно лечение при пациенти и изследване на протеини след пост-транслационна модификация (PTM).
Двуизмерната, или 2D, гел електрофореза е техника, която, използвайки два различни метода на разделяне, може да отдели хиляди протеини от една смес. Една от техниките, SDS-PAGE или електрофореза в полиакриламиден гел на натриев додецил сулфат, не разделя напълно сложните смеси сама по себе си. 2D гел електрофореза сдвоява SDS-PAGE при втори метод, изоелектрично фокусиране или IEF, който се разделя на изоелектрични точки, позволявайки разтварянето на потенциално всички протеини в клетката да лизатира. Това видео демонстрира принципите на 2D гел електрофорезата, обща процедура и някои от нейните биомедицински приложения.
2D гел електрофорезата започва с IEF като първо измерение. Всеки протеин има рН, наречено изоелектрична точка или pI, където нетният заряд е нула. Когато един протеин е изложен на електрическо поле, той се движи към електрода с противоположен заряд. Интересни проби са имобилизирани градиенти на рН или IPG, ленти, заредени с амфолити, които са заровили молекули с киселинни и основни групи. След това към лентата с градиент на рН се прилага електрическо поле, което кара протеините да мигрират, докато достигнат рН, изравнявайки своя pI, където те губят нетния си заряд.
Преди да се изпълни второто измерение, вградените протеини се обработват със SDS, денатурират ги и осигуряват равномерен отрицателен заряд. След като бъдат завършени, IPG лентите се поставят върху полиакриламиден гел. Приложено електрическо поле изтегля протеините към анода с по-големи протеини, бавно движещи се през гела.
След като белтъчната смес е разделена според pI и молекулното тегло, протеомната карта се визуализира с петна и се идентифицират протеините, които представляват интерес.
Сега, когато обсъдихме принципите на 2D гел електрофорезата, нека разгледаме една типична лабораторна процедура.
Преди да може да се извърши експериментът, протеините трябва да се разтворят в среда. Разтварянето на пробата се извършва чрез деагрегиране на протеини с комбинация от хаотропни агенти за нарушаване на взаимодействията на водородна връзка, неионни детергенти, предотвратяване на промяната на протеиновия заряд, редуциращи агенти, разкъсване на дисулфидни връзки и буфери. За да се премахнат интерфериращите обилни протеини и други молекули, материалът се извлича последователно чрез центрофугиране и събиране от получената пелета; последвано от лечение с ендонуклеаза, ензим, използван, за да не се консумира ДНК, която да пречи на експеримента.
След като протеините се разтворят, IPG лентите се приготвят, като се изплакват с разтвор за почистване на ленти и се оставят да изсъхнат с главата надолу. След това на всяка лента се присвоява номер на държача на лентата. След като приключи, лентата се зарежда с бавно, плъзгащо се движение от отрицателния към положителния полюс на клетъчния екстракт. За целите на рехидратацията върху електрода и под лентите с гел се поставя влажна попиваща хартия; IPG лентите след това се подшиват върху инструмента IEF. Прилага се висок електрически ток и протеините започват да мигрират.
След завършване на първото измерение, гелът е готов за SDS-PAGE в устройство за изливане. IPG лентите ще бъдат обработени чрез поставянето им в съдържащия SDS буфер за уравновесяване. Уредът за електрофореза се приготвя с добавяне на буфер за електрофореза. Обработените IPG ленти се събират с форцепс, поставят се върху гелевите плочи и се запечатват с уплътняващ разтвор от агароза. Тогава източник на напрежение прилага електрическо поле, което се задържа, докато най-бързо движещите се протеини са на 1 см над дъното на гела.
След завършване на електрофорезата протеините трябва да се визуализират. Традиционно това се прави чрез оцветяване с Coomassie син или сребърен нитрат. Интересните протеини се прехвърлят от гела чрез Western blot анализ и се анализират.
Вторият подход за идентификация включва изрязване на протеините от гела, смилането им, докато те се анализират чрез масспектрометрия.
След като разгледахме един метод, нека разгледаме някои от приложенията за 2D гел електрофореза.
Едно от най-честите приложения на тази техника е идентифицирането на молекули, участващи в инициирането и прогресирането на заболяването. 2D гел електрофореза, съчетана с масспектрометрия, разпознава регулирането нагоре или надолу на специфични протеини в болните зони в сравнение със здравите.
В допълнение, 2D гел електрофорезата е полезна след прогреса на пациента в отговор на потенциално терапевтично лекарство. Могат да се вземат проби от пациенти по различно време след лечението. По този начин, 2D гел електрофореза, съчетана с Western blot или масспектрометричен анализ, може да открие протеини, свързани с отрицателни реакции като възпаление; или липсата на протеини в закалено състояние.
Друга област на приложение за 2D гел електрофореза е изследването на структурата и функцията на протеина след пост-транслационна модификация или PTM, добавките към протеините, които са след тяхното транслация от иРНК. PTM може да изпълнява различни функции, включително сигнализиране на протеини, регулиране на генната експресия или причиняване на оксидативно увреждане. 2D гел електрофорезата е чувствителна към промени като метилиране или ацетилиране, които могат да причинят промяна в pI и молекулното тегло.
Току-що сте гледали видеоклипа на JoVE за 2D гел електрофореза. Това видео описва принципите на техниката, типична експериментална процедура и някои от нейните приложения в биомедицинската област.